摘要以PRRSV弱毒株膜蛋白(M)和核衣壳(N)蛋白基因为模板，设计的一对含有EcoRI和BamHI酶切位点的引物，通过RT-PCR扩增出一约900 bp的MN基因片段，将此基因片段成功克隆于高效表达载体pBV220，构建成重组质粒pBVMN，导入大肠杆菌DH_5α，经温敏诱导，成功地表达了MN基因。表达产物经SDS-PAGE电泳和Western blot印迹分析，其分子量约34 kD，与兔抗PRRSV高免血清发生反应，经光密度扫描分析，表达产物量占菌体总蛋白的12%。该研究为PRRS基因诊断抗原的研制奠定了基础。

Expression of the M and N Protein Gene of Porcine Reproductive

and Respiratory Syndrome Virus in E.coli

Cai Jiali² Cai Baoxiang¹ Jiang Pin¹

(Animal Medical College, Nanjiang Agricultural University, Nanjiang 210095)

Abstract The primers for RT-PCR were designed on the basis of M and N gene sequence of PRRSV. A gene fragment about 900 bp, which has digestion sites of EcoRI and BamHI, was amplified by RT-PCR. The M and N gene were cloned into expression vector pBV220 and one recombinant PBVMN was constructed which highly expressed a 34 kD protein in E. coli DH_5α. The expressed product was identified by SDS-PAGE and Western blotting, which occupies 12% of total bacterial protein. The report has laid a basis for the development of molecular diagnostic antigen of PRRSV.

Key words Porcine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV), pBV220, Expression, M protein, N protein

猪繁殖和呼吸综合征(PRRS)是新发现的一种动物传染病^［1，2］，其病原PRRSV现归为动脉炎病毒科^［3］。PRRSV为正链单股RNA病毒，基因组总长为15 kb，有8个开放阅读框，PRRSV的M蛋白和N蛋白基因分别位于ORF6和ORF7，有8 bp叠合相连，是较保守的基因序列^［4］，相关的结构蛋白在诊断上有重要意义。pBV220是一个带有双强启动子的表达载体，M和N蛋白基因在pBV220中表达未见报道。本研究拟将M和N基因插入pBV220，探讨MN基因在pBV220中的表达作用，为PRRS基因诊断抗原的研制奠定基础。

1材料和方法

1.1毒株和细胞PRRS弱毒株，美国引进；MARC-145细胞，南京动植物检疫局馈赠。

1.2载体和宿主菌pBV220、DH_5α由南京农业大学生物技术发展中心保存。

1.3酶及化学试剂RT-PCR试剂盒，Promerga公司产品；犊牛血清、EcoRI、BamHI内切酶、Taq DNA聚合酶、T₄DNA连接酶、溶菌酶、HRPO-羊抗兔IgG结合物均为华美生物工程公司产品；DMEM培养基，美国产；其它化学试剂均为国产分析纯或电泳级试剂。

1.4引物的设计与合成根据PRRSV的基因序列和pBV220的酶切图谱，通过DNA同源性、酶切位点、ORF及模拟表达分析，设计了一对能够合成MN蛋白基因及含有EcoRI和BamHI酶切位点的PCR引物，上游引物(P₁)序列为5′CCG AAT TCC AGA GTT TCA GCG G3′，下游引物为5′TGG GAT CCA CCA CGC ATT CTT C3′。

1.5MARC-145细胞培养和PRRSV的制备参考Kim HS介绍方法^［5］，MARC-145细胞培养选用DMEM培养基，含10%犊牛血清，100 u/mL的青霉素和链霉素，长成单层后接种1∶10稀释的PRRS弱毒，37 ℃培养72 h，出现显著的CPE后收获。经三次冻融处理，8 000 r/min离心15 min，取上清，45 000 r/min离心2 h，用原体积1/20的TE缓冲液(10 mmol/L Tris-HCl pH 8.0, 1.0 mmol/L EDTA)稀释沉淀，-20 ℃保存备用。

1.6病毒RNA的制备按侯云德介绍方法进行^［6］。

1.7PRRSV高免血清制备将纯化的PRRSV制成油乳剂。油相用10号白油、司本80、硬脂酸铝。水相将纯化的PRRSV加2%的吐温80。油相和水相按比例混合后乳化成油包水乳剂。选择健康成年公兔2只，间隔一周免疫一次，共免疫4次，初次免疫用0.5 mL/只，以后每次递增0.5 mL/只。作分点肌肉或皮下注射。第4次免疫后10 d颈动脉放血分离血清。琼脂扩散试验测定血清效价，备用。

1.8pBVMN表达质粒的构建以PRRSV RNA为模板，参照Promega的RT-system操作说明进行反转录合成cDNA。再以cDNA为模板，作PCR反应，94 ℃变性1 min，55 ℃复性1 min,72 ℃延伸1 min。pBV220质粒制备按常规方法^［7］，扩增出的MN蛋白基因片段和pBV220质粒分别经EcoRI和BamHI酶切，然后进行连接反应，构建成重组质粒pBVMN，转化入大肠杆菌DH_5α。

1.9MN蛋白的表达及鉴定酶切分析鉴定pBVMN，筛选出的阳性克隆进行温敏诱导表达。重组质粒菌经30℃活化，1∶100稀释到LB培养基，30 ℃摇床增殖，待浓度达到OD₆₀₀=0.2～0.4时，迅速升温至42 ℃继续摇振培养4～6 h。取表达菌液1.5 mL 8 000 r/min离心5 min，去上清，用0.05 mol/L pH 7.2 PBS 100 μL稀释沉淀，加入溶菌酶使含量为500 μg/mL，37 ℃ 1 h，冻融三次，15 000 r/min 10 min，弃上清。沉淀用变性液稀释(8 mol/L尿素，50 mmol/L β-巯基乙醇，pH 7.5 0.1 mol/L PBS)。加等量2倍蛋白载样液，沸水浴煮沸10 min后上样进行SDS-PAGE电脉^［7］。分离胶用12%，积层胶用5%，80V电泳1 h，150 V电泳3 h，考马斯亮蓝染色。用光密度扫描仪对表达量进行估算。同时用未染色的分离胶作Western-blot^［7］，对表达蛋白作进一步鉴定。

Western-blot采取半干转移，用转移电脉仪DYⅢ7B型(北京六一仪器厂)，半干转移电泳槽(Semi-dry transfer cell, U.S.A)进行转移，硝酸纤维素膜为Boeheringer Mannheim公司产品，电压5V，电流1 mA/cm²，转移1.5 h，转移后，加2%BSA pH7.5 PBS封闭37 ℃ 2 h，加1∶100兔抗PRRSV高免血清，4 ℃过夜，37 ℃ 1 h，0.02%吐温 80 pH 7.4 PBS漂洗2次加羊抗兔HRP酶标抗体37 ℃ 1 h，漂洗2次，加DAB染色。

2结果

2.1RT-PCR扩增产物及其重组质粒的鉴定经RT-PCR扩增出的MN基因片段约为900 bp(图1)，与试验设计相同。重组质粒pBVMN经限制性酶消化鉴定获得的DNA片段与扩增产物大小一致(图2)，初步证明为MN蛋白基因。序列分析证实所克隆的基因片段阅读框架与报道一致^［8］(另文报道)。

图1RT-PCR产物的1.5%琼脂糖凝胶电泳分析

1-3.MN cDNA片段；4.λDNA EcoRI/Hind Ⅲ Markers.

Fig.1 Ethidium bromide-stained 1.5% gel showing RT-PCR Product.

Lane 1-3. MN cDNA fragment; Lane 4. λDNA EcoRI/HindⅢ Markers.

图2pBVMN重组质粒EcoRI/BamHI酶切鉴定

1.pBV220质粒. 2-4.EcoRI和BamHI消化的重组质粒，4为克隆筛选的阳性质粒，5λDNA EcoRI/HIndⅢ Markers

Fig.2 Identification of the recombinant plasmid PBVMN with digestion of EcoRI and BamHI, Lane1. pBV220 plasmid; Lane 2 to 4 recombinant plasmids digested by EcoRI and BamHI. Lane 4. cloned pBVMN plasmid digested by EcoRI and BamHI. Lane 5. λDNA EcoRI/HindⅢ Markers.

2.2SDS-PAGE和免疫印迹重组质粒pBVMN在P_RP_L双强启动子控制下进行温控表达，表达产物经SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色分析，显示一条约34 kD大小的表达蛋白染色带(图3)，与试验设计相同。经Western-blot免疫印迹分析，该蛋白带与兔抗PRRSV高免血清反应，而与pBV220质粒菌体裂解液不发生反应(图4)。对染色凝胶进行光密度扫描，表明表达蛋白约占整个菌体的12%。

图3pBVMN表达产物的SDS-PAGE电泳分析

1-2. pBV220；3. pBVMN诱导前；4-8 pBVMN诱导后；9.蛋白分子量标准

Fig.3 Analysis of pBVMN expression products by SDS-PAGE

Lane 1-2 pBV220;Lane 3.uninduced pBVMN;Lane 4-8.induced pBVMN;Lane 9.Markers of protein molecular weight

图4pBVMN阳性克隆表达产物的Western-blot分析