摘要根据小麦黄花叶病毒(WYMV)核苷酸序列测定结果，将WYMV RNA 2上的28kDa蛋白基因克隆到pET11a上，构建了原核表达载体pE2839。SDS-PAGE分析表明，经IPTG诱导，28kDa蛋白基因在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中得到高效表达。以含表达产物的凝胶为抗原，免疫家兔，首次制备了小麦黄花叶病毒RNA2 蛋白特异性抗血清。

Overexpression of 28kDa Protein Encoded by

Wheat Yellow Mosaic Virus RNA2 in E. coli

Su Ning Han Chenggui Li Dawei Hou Zhanjun

Xing Yiming Yu Jialin Liu Yi

(State Key Laboratory for Agrobiotechnology, China Agricultural University, Beijing 100094)

Abstract With polymerase chain reaction (PCR) a fragment encoding the 28 kDa protein of wheat yellow mosaic virus (WYMV) RNA2 was amplified and constructed into plasmid of pET11a for prokaryotic expression. BL21 (DE3) of E.coli transformed with the recombinant plasmid of pE2839 was induced to specifically express the 28 kDa protein in high level. The expressed 28 kDa protein was purified from SDS-polyacrylamide gels and the antiserum against the protein was raised in rabbit. In Western-blotting analysis, the antiserum reacted with the 28kDa protein.

Key words Wheat yellow mosaic virus, Protein gene, Prokaryotic expression, Antiserum

小麦黄花叶病是亚洲小麦产区广为流行的一种真菌传病毒病害，七十年代末在我国首次报道^［1］。该病害是由小麦黄花叶病毒(wheat yellow mosaic virus, WYMV)侵染所引起的，表现为小麦植株矮化，成穗率低，严重影响小麦产量。由于其传播介体禾谷类多粘菌(Polymyxa graminis)为植物根部专性寄生真菌，其休眠孢子抗逆力强，可被释放到土壤中存活多年，所以目前除选择抗病品种外，无其它有效的防治措施。

WYMV为大麦黄花叶病毒属(Bymovirus)成员，基因组由长、短两条单链正意RNA构成^［2，3］。根据WYMV相近的其他大麦黄花叶病毒属病毒的研究结果，此类病毒RNA2编码两种分子量分别为28kDa和70kDa的蛋白，可能与介体的传播有关^［2］。本研究在对小麦黄花叶病毒cDNA合成及序列测定的基础上(未发表)，将RNA2编码的28kDa蛋白基因片段克隆到原核表达载体中，获得了高效表达并制备了其相应的特异性抗血清，为今后对28kDa蛋白的检测和功能研究奠定了基础。

1材料与方法

1.1菌株和质粒

大肠杆菌DH5α、BL21(DE3)pLysS和原核表达载体pET11a由本室保存。含有WYMV 28kDa蛋白基因片段的cDNA重组质粒pGWH44为本室克隆。

1.2酶及试剂

Western blotting试剂盒购自Promega公司。蛋白分子量标准购自Pharmacia公司。硝酸纤维素膜购自Schleicher & Schuell公司。IPTG等其他化学试剂及各种限制性内切酶或工具酶购自华美生物工程公司。引物由中国科学院微生物所技术室合成。

1.3PCR引物合成、基因扩增与表达载体的构建

根据本室对WYMV RNA2 cDNA的序列测定结果(GenBank登录号：AF041041)，结合对大麦黄花叶病毒属其他病毒RNA2序列的结构分析，分别设计了针对28kDa蛋白编码区上、下游两端序列的引物P1和P2。引物具体序列如下：

引物P1：5′-TTTCCAGTACTATGGCATCCACCAG-3′与WYMV RNA2的148～173核苷酸(nt)相对应，并引入一个ScaⅠ位点。

引物P2：5′-GGCCTGGATCCTCAGCTCAGCCGAC-3′与WYMV RNA2的940～915nt互补，并引入一个BamHI位点和一个翻译终止密码子。

利用引物P1与P2，以含有WYMV RNA2 28kDa蛋白基因的cDNA重组质粒pGWH44为模板进行PCR扩增，电泳回收扩增产物后，以ScaⅠ和BamHI双酶切处理。载体质粒pET11a用NdeⅠ酶切，经DNA聚合酶Ⅰ Klenow片段补平后再用BamHI酶切。经处理的PCR产物及载体进行连接，转化大肠杆菌DH5α后筛选重组子，PCR鉴定含有28kDa蛋白基因的非融合蛋白原核表达载体。

1.428kDa蛋白基因的诱导表达及SDS-PAGE电泳分析

将筛选获得的阳性重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS，挑取单菌落接种于3mL LB液体培养基(含氨苄青霉素100μg/mL)，于37℃活化过夜后，按1∶100稀释加入到6mL LB液体培养基中(含氨苄青霉素100μg/mL)，振荡培养至OD₆₀₀值为0.7～0.9，加入IPTG至终浓度为0.4mmol/L，继续于37℃摇床培养3～4h。离心集菌后加入500μL样品缓冲液(40mmol/L Tris-HCl, pH6.8,10%甘油， 2%SDS，5%巯基乙醇，0.1%溴酚兰)，煮沸10min，置4℃备用。

将诱导产物经12.5%的SDS-PAGE电泳分析，用考马斯亮蓝R-250染色，脱色(脱色液∶10%甲醇，10%冰乙酸)至背景清晰为止。

1.3及1.4两项内容所涉及的常规分子生物学技术均参照Sambrook的方法^［4］。

1.5抗血清制备及Western-blotting检测

参照Hager等^［5］的方法染色，从凝胶中切下特异性表达蛋白条带，按1∶1比例(W/V)加入PBS缓冲液(0.14mol/L NaCl, 2.7mmol/L KCl,1.5mmol/L KH2PO4, 8.1mmol/L Na2HPO4)，于冰浴中研磨。用PBS缓冲液适当稀释回收的蛋白混合物后，加入等体积的福氏不完全佐剂(1.5g羊毛脂+8mL石蜡油)进行乳化。参照Hames的方法^［6］制备WYMV 28kDa蛋白抗血清，每次免疫剂量为2.5mL乳化抗原溶液(抗原约为3mg)。采血后收集的抗血清加入0.1%迭氮钠，分装后-20℃贮存。

参照Towbin等人的方法^［7］进行Western-boltting检测。

2结果

2.1原核表达载体的构建

根据本室对WYMV RNA2的序列分析结果(GenBank登录号：AF041041)，28kDa蛋白编码区起始于160nt，位于一个约98kDa的多肽前体编码区的5′末端。与相近的大麦黄花叶病毒(BaYMV)和大麦和性花叶病毒(BMMV)的研究结果比较，WYMV 28kDa蛋白可能是在921nt上、下游编码的氨基酸G/S位点，通过翻译后切割所生成的。因此，本文在引物P2中将922～924nt处的核苷酸TCA变为TGA，从而引入一个终止子。并在起始密码子ATG上游和引入的终止子TGA下游分别引入相应的酶切位点，以便于重组DNA操作。

经PCR扩增后，获得一个长度约为800个核苷酸的DNA片段，与设计期望长度相符。按1.3所述，该片段及表达载体pET11a经酶切、抽提处理后，进行连接并转化大肠杆菌DH5α。挑取单菌落进行培养并提取重组质粒，经PCR鉴定，得到重组质粒pE2839(见图1)。

图1表达载体pE2839的PCR鉴定

Fig.1 Identification of pE2839 by PCR

A:Products from pGWH44;

B:Products from pE2839;

C:λ DNA/Hind Ⅲ+EcoRⅠ markers.

2.2表达产物的SDS-PAGE分析

将重组质粒pE2839转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS，进行诱导表达。取20μL上样，SDS-PAGE电泳后，考马斯亮蓝染色结果表明：经IPTG诱导后，含有重组质粒pE2839的菌株可特异地产生一条与WYMV RNA2 28kDa分子量相当的蛋白条带(见图2)。光密度扫描估测结果显示，28kDa蛋白的相对表达量占菌体总蛋白的10%以上(结果未表示)。

图2SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析

Fig.2 SDS-PAGE analysis of expression products

1.BL21(DE3)/pET11a;

2.BL21(DE3)/pE2839.

A.Non-induced; B.Induced;

M.Protein markers (94,67,43,30,20,14kDa).

2.3抗血清制备和Western-blotting检测

经SDS-PAGE电泳后，染色回收特异性表达的28kDa蛋白条带。免疫家兔，获得了WYMV RNA2 28kDa抗血清。

利用获得的28kDa蛋白抗血清进行Western-blotting分析。结果表明，所获得的抗血清仅与含有重组质粒pE2839的大肠杆菌诱导表达产物反应，产生一条清晰的着色带，而与其他对照不发生反应(图3)。由此可见，所产生的抗血清可以与原核表达的WYMV RNA2 28kDa蛋白特异结合，为特异性抗血清。

图3利用28kDa蛋白抗血清