摘要利用高效持续带毒增殖的细胞株传代增殖获取甲型肝炎病毒(HAV)。采用不连续蔗糖/甘油密度梯度超速离心分离高度纯化的HAV颗粒。温和病毒裂解液裂解病毒后，运用高效液相色谱分离出三种蛋白，SDS-PAGE和Western-blot证实所分离蛋白为HAV三种主要结构蛋白VP₁、VP₂和VP₃，蛋白含量较高。

Separation, Purification and Identification of

Structural Proteins of Hepatitis A Virus

Lu Yinping¹ Lin Yulin² Yao Xuejun² Qin Qizhen² Li Hui² Zhang Weiying²

¹ (Department of Virology, Union Hospital of Tongji Medical University, Wuhan 430022)

² (Virus Research Institute, Hubei Medical University, Wuhan 430071)

Abstract A cell line persistently infected by Hepatitis A virus (HAV) was ultilized to produce high yield viral particles of HAV. HAV particles were recovered in a single ultracentrifugation step through discontinuous sucrose/glycerol density gradients. Three kinds of major structural protein of HAV were separated and purified by high performance liquid chormatography. SDS-PAGE demonstrated the molecular weight of three structural proteins of HAV being 33, 29 and 27 kD. The special immune reactions were shown in Western-blot test, suggesting the proteins with 33, 29 and 27 kD are VP1, VP2 and VP3 of the virus, respectively. The total contents of the proteins, VP1, VP2 and VP3 were respectively 687, 220.8, 68 and 213.6 μg from 11 200 cm+2 cells infected with HAV. The highly purified particles and sturctural proteins of HAV may be used in research for the development of vaccine, clinical diagnosis and pathogenesis of HAV.

Key words Hepatitis A virus, Structural proteins, Separation, Purification, Identification

甲型肝炎病毒的发病率在各型病毒性肝炎中仍居首位，然而HAV感染的始发机理一直都是亟待解决但尚未弄清楚的课题，至今没有阐明感染始发有关衣壳蛋白种类及各种衣壳蛋白在感染始发中的相互作用。因此有效分离出高度纯化和保持蛋白天然空间结构的HAV三种主要结构蛋白VP₁、VP₂和VP₃，对研究解决HAV感染始发机理具有重要意义。国外有学者报道分离出几种HAV结构蛋白，但因实验中使用蛋白变性剂，所获蛋白为变性结构蛋白^［1，2］；国内尚未见到有关HAV结构蛋白分离纯化的报道。本研究采用超速离心和高效液相色谱技术，首次成功分离出具有蛋白本身天然结构的HAV的三种主要结构蛋白，旨在为解决HAV感染始发机制研究提供丰富材料和有力手段。

1材料和方法

1.1细胞和病毒HAV HM-175株适应于恒河猴胚肾传代细胞FRhK4并形成持续感染，参考Simmonds等方法^［3］传代，每周传代一次，可维持生长两周。

1.2材料和仪器超速离心机为日立SCP85H型，高效液相色谱仪为岛津LC-6A型，电泳仪为Bio-Rad 3000Xi型。抗HAV VP₁、VP₃单克隆抗体由上海市传染病医院免疫室提供，甲肝患者恢复期血清由武汉市传染病医院提供。

1.3间接免疫荧光检测细胞中HAV抗原按Provost等^［4］方法加以改进，HAV感染细胞用胰酶消化后制成抗原片，加入HAV患者恢复期血清，湿盒中置37 ℃恒温箱45 min，洗涤吹干，加入羊抗人IgG荧光抗体，37 ℃孵育45 min，洗涤吹干后在荧光显微镜下观察，测细胞阳性率，确定HAV在FRhK4细胞增殖高峰时间。

1.4不连续蔗糖/甘油密度梯度超速离心制备高纯度HAVHAV持续感染传代细胞培养两周后弃去培养液，用胰酶/EDTA消化细胞，低速离心收集细胞沉淀，共收集400方瓶(28 cm²/瓶)细胞沉淀物，加入终浓度1%NP40裂解细胞膜，离心去除细胞核和细胞残渣，加入终浓度为2%的SDS，以进一步裂解剩余少量细胞残余物。12 mL水平离心管用带细长针管注射器由管底依次缓慢加入1.8 mL 100 g/L的蔗糖(含1%SDS)、1.8 mL 200 g/L的蔗糖、1.8 mL 300 g/L的蔗糖、0.5 mL体积分数为80%的甘油，然后在离心管上部加入5.3 mL粗制HAV悬液，离心管放入水平离心转头(Hitashi SW40), 37 000 r/min(170 000×g)，18 ℃离心6 h，最后用带细长针头注射器从管底收集1 mL液体，即为高纯度病毒悬液，其它部分也分部收集1 mL供检测^［5，6］。

1.5高效液相色谱(HPLC)分离HAV结构蛋白超速离心所得HAV加入终浓度为4 mol/L盐酸胍(GuHCl)和1 mmol/L二硫苏糖醇(DTT)，50 ℃恒温水浴10 min以裂解HAV颗粒。HPLC色谱柱为Shim-pack DIOL-150，流动相为0.01 mol/L pH6.6 PBS，流速为0.6 mL/min，紫外检测器波长为280 nm，温度为25 ℃，每次进样量为50 μL，出峰后从半峰高起收集各蛋白峰^［2，7］。

1.6SDS-PAGE测定蛋白质分子量分离胶浓度为12.5%，浓缩胶浓度3%，样品加入处理液煮沸3 min后加样电泳，同时加入标准分子量作对照，稳流电泳，开始电流为15 mA，样品浓缩成线进入分离胶后加大到30 mA，总共电泳约5 h，剥胶后考马斯亮蓝染色。电泳后根据标准蛋白分子量和其相对迁移率在半对数坐标纸上作分子量标准曲线，然后根据待测蛋白的相对迁移率从标准曲线上查知其分子量。

1.7Western-blot样品经SDS-PAGE后，将凝胶上蛋白条带电泳转印到硝酸纤维膜上，丽春红染色后将蛋白条带切下，条带用1% BSA 4 ℃封闭过夜，TBS洗涤，置反应槽内，加1.5 mL TBS-Tween20稀释的一抗HAV患者恢复期血清或鼠抗HAV McAb,37 ℃温箱振荡孵育2 h，TBS洗涤后加入酶标二抗羊抗人IgG-HRP或羊抗鼠IgG-HRP 1.5 mL，37 ℃振荡孵育2 h。洗涤后加入1.5 mL底物液，振荡15 min，待充分显色后，自来水冲洗终止反应。

1.8蛋白质薄层扫描将SDS-PAGE后剥下的凝胶进行薄层扫描，紫外检测，波长为280 nm，根据峰面积计算蛋白质含量(标准蛋白作为对照)及HPLC分离蛋白回收率。

2结果

2.1IFA检测HAV在细胞内增殖不同培养时间细胞所做抗原片，IFA在荧光显微镜下见到感染HAV FRhK4细胞胞浆内有大量黄绿色砂粒状荧光颗粒，培养一周后细胞荧光阳性率达69.4%，培养两周后阳性率几乎达100%。

2.2IEM观察超速离心所得HAV透射电镜下，超速离心收集的离心管底1 mL悬液观察到大量聚集在一起的典型的HAV颗粒，大小约27nm，无包膜，可见到实心颗粒和空心颗粒，以实心颗粒为主(见图1)。其它分部收集物仅见少量HAV颗粒或无。

图1负染免疫电镜照片。示超速离心后样品HAV被抗HAV McAb凝集成的病毒聚集体。

病毒直径约27 nm，分实心和空心颗粒两种(60000X)。

Fig.1 HAV with typical morphology recovered from ultracentrifugation were observed by immune electron microscopy (IME) (60,000X)

2.3HPLC分离HAV结构蛋白及重复性分离到三个大致呈正态分布的较窄的蛋白峰，保留时间分别为10.72 min、13.73 min、16.58 min(见图2)，将收集到三个峰样品分别重新进样，各自得到一个峰，保留时间与原最初样品保留时间相对应。样品多次进样出峰和保留时间也无改变。

图2高效液相色谱分离HAV结构蛋白三个洗脱峰。保留时间分别为10.72 min、13.73 min、16.58 min。

Fig.2 The structural proteins of HAV were separated by high liquid chormatography (HPLC),three peaks of protein with elution time being 10.72 min, 13.73 min and 16.58 min were respectively collected

2.4分子量测定HAV结构蛋白分子量分别为33、29、27 kD；HPLC所得三个峰样品分子量：保留时间10.72 min的为33 kD；保留时间13.73 min的为29 kD；保留时间16.58 min的为27 kD(见图3)。

图3SDS-PAGE照片。1.标准分子量； 2.HAV； 3.HPLC分离物(16.58 min)； 4.HPLC分离物(13.73 min)；

5.HPLC分离物(10.72 min)。

Fig.3 SDS-PAGE demonstrated the molecular weight of three structural proteins of hAV. Lane 1, molecular weight markers; Lane 2, virions of HAV; Lane 3 to 5, products of HPLC with different elution time.

2.5Western-blot鉴定各结构蛋白

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