摘要将含有鸡传染性支气管炎病毒S1基因cDNA的重组转移质粒pSXIVVI⁺X3-S1.Holte和pSXIVVI⁺X3/4-S1.Holte分别与粉纹夜蛾核型多角体病毒TnNPV-SVI^-G DNA (OCC^-, gal⁺)共转染草地夜蛾(Sf9)细胞，经空斑纯化得到重组病毒TnNPV-(X3)S1. Holte-OCC⁺和TnNPV-(X3/4)S1.Holte-OCC⁺。将重组毒株分别感染Tn-5B1细胞，并进行SDS-PAGE与Western-blot检测。结果表明，TnNPV-(X3/4)S1.Holte-OCC⁺在感染的细胞中高效表达了S1蛋白，SDS-PAGE凝胶薄层色谱分析结果显示，感染病毒后72 h S1蛋白的表达量占细胞内总蛋白量的35.8%，而TnNPV-(X3)S1.Holte-OCC⁺感染的细胞内检测不出S1蛋白。经分析认为这一差异主要来自S1基因翻译起始位点及其附近的周围环境。

Preliminary Study on Expression Level of the S1 Gene of Avian

Infectious Bronchitis Virus in a Baculovirus System

Song Yanhua Liu Fuan

(Department of Veterinary Medicine, South China Agricultural University, Guangzhou 510642)

Abstract The recombinant transfer plasmids pSXIVVI⁺X3-S1.Holte and pSXIVVI⁺X3/4-S1.Holte containing S1 gene cDNA of avian infectious bronchitis virus and the parent virus (TnNPV-SVI^-G) DNA were used to co-transfect Spodotera frugiperda (Sf) cells. The recombinant viruses TnNPV-(X3)S1.Holte-OCC⁺ and TnNPV-(X3/4)S1.Holte-OCC⁺, which included the S1 gene and could form polyhedra, were plaque-purified. The expression products of S1 gene were detected by SDS-PAGE and Western blotting in Tn-5B1 cells infected with the recombinant viruses. The S1 protein with a molecular weight of 100 kD was expressed in the cells infected with TnNPV-(X3/4)S1.Holte-OCC⁺ at high efficiency, the expression level in Tn-5B1 cells 72 h postinfection being 35.8% by SDS-PAGE gel thin-layer chromatography. No expression product was detected by SDS-PAGE and Western-blotting in Tn-5B1 cells infected with TnNPV-(X3)S1.Holte-OCC⁺. The expression level depends mainly upon the translational start site of the S1 gene and its flanking sequences.

Key words Avian infectious bronchitis virus (IBV), S1gene, Baculovirus expression vector, Expression

鸡传染性支气管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus, IBV)是冠状病毒科(Coronaviridae)的主要成员之一。IBV的多血清型以及变异株的不断出现，使传统的IB疫苗预防效果往往不够理想^［1］。IBV基因工程疫苗的研制是改进传统IB疫苗的一个重要方向。我们已经将IBV的主要免疫原基因S1克隆到形成多角体的杆状病毒表达载体并构建出两个表达质粒：pSXIVVI⁺X3-S1.Holte和pSXIVVI⁺X3/4-S1.Holte^［2］，S1基因在这两个质粒中的翻译起始位点及起始位点的周围环境不同^［2］，将影响S1基因的表达水平。我们以这一点为基础，对它们在昆虫细胞中的表达情况进行了研究，并初步探讨外源基因与ATG附近序列对翻译的影响。

1材料与方法

1.1材料

含IBV Holte株S1基因的杆状病毒重组转移质粒pSXIVVI⁺X3-S1.Holte(含先导序列)和pSXIVVI⁺X3/4-S1.Holte(先导序列作为融合短肽)由华南农业大学动医系禽病研究室构建^［2］。

草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)Sf9、Tn-5B1细胞以及含合成启动子和β-半乳糖苷酶基因的无包涵体粉纹夜蛾重组毒株TnNPV-SVI^-G由中山大学生物防治国家重点实验室提供^［3］，细胞培养基为TC-100培养基(GIBCO公司)补加10%小牛血清。

一抗为鸡抗IBV Holte株抗血清，由本研究室制备；二抗为抗鸡IgG McAb-HRP，由广东省农业科学院兽医研究所杜伟贤研究员惠赠。脂质体转染试剂(Lipofectin)为GIBCO BRL公司产品。

1.2方法

1.2.1病毒DNA的提取和重组病毒的构建

病毒DNA的提取参照Summers等(1987)的方法^［4］进行，共转染则按脂质体使用说明进行。重组毒株用PCR进行鉴定，使用扩增IBV S1基因的引物Y₁、Y₂。

1.2.2S1基因在昆虫细胞中的表达与检测

1.2.2.1样品制备取对数生长的Tn-5B1细胞，用高滴度病毒原液(MOI控制在5～10之间))吸附细胞1 h，弃病毒液，加入新鲜的培养基，27 ℃下培养，在病毒感染后72 h收集细胞样品，供SDS-PAGE和Western印迹分析用。

1.2.2.2SDS-PAGE和Western免疫印迹SDS-PAGE分离胶的浓度为8%，浓缩胶的浓度为5%。Western免疫印迹按Sambrook等(1989)的方法^［5］。

2结果

2.1含IBV Holte株S1基因cDNA的重组杆状病毒的构建与鉴定

将高纯度的重组转移载体质粒pSXIVVI⁺X3-S1.Holte和pSXIVVI⁺X3/4-S1.Holte分别与亲本毒株TnNPV-SV1^-G DNA共转染Sf9细胞。重组毒株具有产生多角体和X-Gal染色为白色两个标记，用这两标记，经多轮(3～5次)空斑纯化，得到纯的重组毒株TnNPV-(X3)S1.Holte-OCC⁺和TnNPV-(X3/4)S1.Holte-OCC⁺。

用扩增S1基因的引物Y₁、Y₂对重组毒株TnNPV-(X3)S1.Holte-OCC⁺、TnNPV-(X3/4)S1.Holte-OCC⁺的DNA进行PCR鉴定，电泳显示一条约为1 760 bp大小的特异带(图未显示)，与IBV Holte株S1基因cDNA的大小完全符合^［2］，而以亲本型病毒DNA的PCR扩增结果为阴性，证明S1基因cDNA片段已插入重组毒株基因组中。

2.2S1基因在昆虫细胞中的表达与检测

将两个重组毒株TnNPV-(X3)S1.Holte-OCC⁺和TnNPV-(X3/4)S1.Holte-OCC⁺分别感染Tn-5B1细胞后进行细胞内蛋白SDS-PAGE电泳和Western印迹分析(图1、图2)。结果显示，重组毒株TnNPV-(X3)S1.Holte-OCC⁺感染后细胞内检测不到S1蛋白，而重组毒株TnNPV-(X3/4)S1.Holte-OCC⁺感染的细胞中，S1基因获得了高效表达，该蛋白的分子量约为100 kD，与预期的完全糖基化后的产物大小基本一致，经CS-930双波长薄层扫描仪(日本产品)在波长为590 nm所进行的薄层色谱分析显示，病毒感染后72 h，S1蛋白表达量占细胞内总蛋白量的35.8%。

图1感染病毒的细胞总蛋白的SDS-PAGE分析

fig.1 SDS-PAGE analysis of the proteins from infected cells

a: Tn-5B1 cells infected with TnNPV-SVI^- G (parent); B:Tn-5B1 cells infected with TnNPV-(X3/4)S1.Holte-OCC⁺ (recombinant); C: Tn-5B1 cells infected with TnNPV-(X3)S1.Holte-OCC⁺(recombinant); D: Tn-5B1 cells infected with TnNPV(wild type); M: Mid-range protein molecular weight markers; the arrow indicates the expressed product of the S1 gene.

图2S1蛋白的Western-blot检测

fig.2 Western-blot detection of the S1 glycoprotein expressed in Tn-5B1 cells

a:Tn-5B1 cells infected with TnNPV-SVI^- G; B: Tn-5B1 cells infected with TnNPV-(X3/4)S1.Holte-OCC⁺； C: Tn-5B1 cells infected with TnNPV-(X3)S1.Holte-OCC⁺(recombinant); m: Mid-range protein molecular weight markers; the arrow indicates the expressed product of the S1 gene.

为了确定S1基因的表达产物是否有部分为分泌性表达，本研究对重组病毒感染的细胞上清同时进行了SDS-PAGE电泳和Western印迹分析，结果显示阴性，从而表明S1基因的表达产物为非分泌性表达。

3讨论

本实验结果表明，IBV Holte株S1基因正确地插入到TnNPV基因组中构成两个重组毒株：TnNPV-(X3)S1.Holte-OCC⁺、TnNPV-(X3/4)S1.Holte-OCC⁺，后者使S1基因在昆虫细胞中获得了高效表达。1983年Cavanagh等^［6］确定IBV m₄₁株的S1糖蛋白经糖基化后分子量约为90 kD，M₄₁株的S1蛋白由520～538氨基酸个残基构成，S1蛋白上的N-糖基化位点有17个，未糖基化的分子量约为56 kD，糖基化后分子量增加34 kD之多。而IBV Holte株S1蛋白上的N-糖基化位点也有17个，完全糖基