摘要蛋白多肽二级结构的电脑预测表明，非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)j5R阅读框编码12.9 kDa膜蛋白。该蛋白的C末端含有一个潜在抗原决定簇，针对其合成肽的抗体能在ASFV感染细胞和病毒颗粒中检测到23或25 kDa(取决于不同毒株)特异蛋白。免疫荧光试验显示，j5R蛋白主要位于感染细胞的病毒复制部位。油水两相分离和细胞分级分离试验结果证明j5R蛋白是膜相关蛋白。

Computer-Based Prediction and Experimental Confirmation of

the j5R Membrane Protein of African Swine Fever Virus

Sun Huaichang

(Dept. of Vet. Med., Anim. Sci. and Vet Med. Coll., Yangzhou Univ., Yangzhou 225009)

Linda K Dixon R. M. E Parkhouse

(Institute for Animal Health, Pirbright Laboratory, Ash Road, Pirbright, Surrey GU24 ONF, UK)

Abstract The j5R open reading frame (ORF) of African swine fever virus was predicted by computing to encode a 12.9 kDa protein with two successive N-terminal transmembrane domains and one C-terminal antigenic epitope. Antibodies raised against a synthetic peptide derived from the C-terminal epitope detected a specific protein of 23 or 25 kDa (depending on different isolates) in ASFV-infected cells or purified extracellular ASFV virions. Immunofluorescence showed that the j5R protein was mainly located in the virus assembly sites within ASFV-infected cells. Phase separation of purified extracellular ASFV virions and fractionation of ASFV-infected cells demonstrated that the j5R protein was in the detergent phase and membrane fraction, confirming that the j5R protein was membrane-associated.

Key words African swine fever virus(ASFV), j5R ORF, Membrane protein

病毒膜蛋白是激发机体产生免疫应答或参与病毒装配的重要蛋白质。这些蛋白质借助其跨膜片段的疏水性质，将其多肽链导向脂质单位膜，因此常存在于有囊膜病毒或其感染细胞的表面。前者与病毒吸附、介导细胞膜融合或穿透细胞、参与病毒感染早期过程密切相关，针对这些病毒蛋白的抗体对阻止病毒感染扩散起着至关重要的作用。后者具有表面和外部抗原的强免疫原性质，常常是激发机体免疫应答，尤其是细胞毒性T淋巴细胞的有效抗原^［1］。经电脑预测，ASFV j5R阅读框编码由111个氨基酸组成的膜蛋白。本文报道该蛋白的表达与鉴定。

1材料和方法

1.1材料

用于蛋白多肽二级结构分析的GCG程序购于美国威斯康星大学。除另有说明外，所有化学药品均来自Sigma公司。分子生物学试剂，包括限制性内切酶、Taq DNA聚合酶 、连接酶、强化化学荧光蛋白转印杂交(Enhanced Chemiluminescent Western Blot, ECL Western Blot)试剂等，分别购自德国Beohinger Mannheim、美国Promega及英国Amersha公司。所有细胞、病毒、血清等均由英国动物健康研究所提供。

1.2方法

1.2.1蛋白多肽的二级结构分析

先将ASFV(Malawi LIL 20/1)j5R阅读框的核苷酸序列^［2］转译成氨基酸序列，然后用Peptidestructure程序预测其抗原性(antigenicity)、弹性度(flexibility)、亲水性(hydrophilicity)及表面概率(surface probability)；用Sigcleave程序预测其蛋白水解部位；用Motifs程序预测其潜在氨基酸功能区。

1.2.2多肽合成和抗体制备

根据电脑预测，j5R蛋白的第86～103个氨基酸具有较高的抗原指数，为潜在的抗原决定簇(图1)。根据此决定簇序列，用固相法^［3］合成由17个氨基酸(亮-赖-谷-丙-谷-天冬酰胺-赖-酪-色-色-谷氨酰胺-天冬酰胺-酪-天冬-脯-酪-丝氨酸)组成的多肽。

将500 μg合成肽溶于750 μL PBS中，与等体积佛氏完全佐剂混匀后分5点(1点肌肉，4点皮下)注射一只新西兰白兔。注射后第21和42天，每只兔用1/2剂量与不完全佐剂混合的合成肽加强免疫。第64天时，免疫兔的ELISA滴度仍不很高，遂用500 μg合成肽再次加强免疫。3周后采血，分离血清。兔抗合成肽免疫球蛋白用ProtOn亲和柱按厂家(Multiple Peptide system)说明提纯。

1.2.3病毒纯化和病毒蛋白抽提

用Percoll梯度离心法从ASFV(Uganda株)感染细胞上清中提纯细胞外病毒按Carrascosa法^［4］进行。

将100 μL纯化病毒置于离心浓缩管(Centricon-100)中，向管中加入10% N-Octyl β-D-glacopyranoside(NOG)至最终浓度为0.1%，4 ℃孵育1 h后离心(3000 r/min, Denley BR 401低温离心机)分离病毒颗粒和洗脱蛋白，收集下管中的抽提蛋白，病毒再分别用0.25%、0.5%和1.0%NOG按上述方法抽提一次。抽提蛋白和抽提后的病毒用兔抗j5R合成肽抗体进行ECL Western Blot分析。

1.2.4病毒感染细胞

猪骨髓细胞培养按发表的方法^［5］制备。向长成单层的10 mL细胞管中加入0.5 mL Malawi LIL 20/1 ASFV病毒液，继续培养至出现明显血吸附现象(约48 h)时倾去培养液，并向培养管中加入0.5 mL细胞裂解缓冲液(50 mmol/L Tris HCl, pH8.0, 120 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA, 0.5%NP40)，裂解细胞保存于-70 ℃备用。

1.2.5ECL Western blot

10%SDS-PAGE按常规方法进行。电泳后，用Western Blotter按厂家说明将蛋白转印到Immobilon-P膜上(0.8～1.0 mA/cm²膜，25～30 min)。蛋白杂交按常规方法进行，封闭液为含10%犊牛血清和0.1% Tween 20的PBS， 第一抗体为兔抗j5R合成肽Ig，第二抗体为辣根过氧化物酶标记的葡萄球菌A蛋白，用ECL Western Blotting Detection Reagents按厂家说明显示杂交信号。

1.2.6免疫荧光

BSC40细胞培养于Lab-Tek细胞培养仓内。待细胞接近单层时，用Uganda ASFV感染细胞(37 ℃, 2 h)。于感染后不同时间倾去培养液，并用PBS洗涤后进行免疫荧光染色。表面染色直接用活细胞或经4%副甲醛固定(室温30 min)的细胞进行；细胞内染色的细胞先用冷却甲醇固定5 min，然后按常规方法染色。第一抗体为兔抗j5R合成肽Ig，第二抗体为FITC标记的羊抗兔IgG。

1.2.7两相分离

按Bordier的两相分离试验法^［6］，用Triton X-114抽提纯化ASFV颗粒膜蛋白。

1.2.8细胞分级分离(fractionation)

细胞分级分离按Chatis和Morrison的方法^［7］进行。感染细胞为IBRS 2细胞，毒株为Uganda株，阳性对照为35s标记的水泡性口炎病毒(Vescular stomatitis virus, VSV)感染的IBRS 2细胞。

2结果

2.1蛋白多肽的二级结构分析

ASFV(Malawi LIL 20/1)的j5R阅读框位于该病毒基因组SalⅠ酶消化后的J片段，由病毒基因组的正链编码，阅读方向朝向基因组的右端。该阅读框由333 bp组成，编码由111个氨基酸组成的12.9 kDa蛋白质^［2］。

用Prosrch和Tfasta程序分别查询Swissprot(Version 28)和Gen EMBL资料库，未发现与之同源的氨基酸序列。查询Prosite资料库(错配=0)发现1个潜在糖基化部位(第65个残基)和4个磷酸化部位(图1)。Peptidestructure程序分析表明，j5R多肽链的N-末端第1～20和25～40个残基的疏水值较高，为潜在膜蛋白跨膜区(图1)。

图1ASFV j5R蛋白多肽的2级结构分析。纵坐标代表亲水值(＞0)和疏水值(＜0)，顶排数字代表氨基酸残基位置，黑色区域代表潜在的膜蛋白跨膜区，阴影区域代表用于制备j5R合成肽的潜在抗原决定簇，P代表磷酸化部位，G代表N-交联的糖基化部位。

Fig.1 Secondary structure analysis of ASFV j5R polypeptide. The ordinate represents hydrophilicity (＞0) and hydrophobicity (＜0), top row the positions of amino acid residues, darkened areas the putative transmembrane domains, shaded area the potential antigenic determinant used to make the j5R synthetic peptide, P phosphorylation sites, and G N-linked glycosylation site, respectively.

2.2 j5R蛋白在病毒感染细胞中的表达与定位

用亲和层析纯化的兔抗j5R合成肽的抗体，对ASFV Malawi LIL 20/1株感染48 h后的猪骨髓细胞进行ECL Westen blot分析显示，j5R阅读框C端序列特异抗体能在病毒感染细胞中检测到分子量为23 kDa的特异蛋白，而正常兔血清不能显示此蛋白，正常猪骨髓细胞中也无此蛋白(图2)。