摘要应用聚合酶链反应技术，用设计带有限制性酶切位点的引物，特异地扩增从起始密码子开始的1.8kb新城疫病毒(NDV)血凝素-神经氨酸酶(HN)基因开放式阅读框，然后插入pTK₂B的Nhe Ⅰ位点，构建了含NDV HN基因的插入载体 pTKHN₁和pTKHN₂，再与感染火鸡疱疹病毒(HVT)细胞的总DNA共转染鸡胚成纤维细胞(CEF)，经有限稀释法和Dot-blot筛选，得到含有HN基因的重组体rHVT₁和rHVT₂。经组织培养传代和Western blot分析，表明重组体在感染细胞中表达了HN蛋白。重组体在CEF上的生长特性与亲本病毒相同，且在连续传代过程中保持稳定。为国内新城疫基因工程疫苗研制奠定了基础。

Construction of a Recombinant Herpesvirus of Turkey Expressing

the Haemagglutinin-Neuraminidase Gene of Newcastle Disease Virus

Zhao Jun Zhang Xiugen Chen Puyan Cai Baoxiang

(College of Animal Medicine, Nanjing Agricultural University, Nangjing 210095)

Abstract A 1.8 kb fragment of Newcastle disease virus (NDV) haemagglutinin-neuraminidase (HN) gene was amplified by polymerase chain reaction (PCR) with primers containing enzyme cleavage sites, and inserted into a nonessential gene of herpesvirus of turkey (HVT). Recombinant viruses were screened by Dot-blot hybridization with digoxigenin labelled probe and purified by plaque-formation technique. The expression of NDV HN gene can be detected by Western blotting in CEF cells infected with recombinant virus. Recombinant HVT strains were replicated stably in cell cultures.

Key words NDV, HN gene, Recombinant HVT

新城疫病毒(NDV)是目前世界养禽业最重要的病原之一，给养禽业造成极大危害。该病毒引起一种主要侵害鸡和火鸡的急性、高度传播性疾病，导致鸡的严重呼吸困难和高死亡率。NDV是副粘病毒科腮腺炎病毒属成员，是一种具有囊膜、负链、不分节段的RNA病毒。病毒粒子包含两种囊膜蛋白：融合(F)蛋白和血凝素-神经氨酸酶(HN)蛋白。HN蛋白兼有血凝性和神经氨酸酶活性，它们分别负责病毒粒子与其细胞受体的起始吸附和受体破坏活性^［1］。F蛋白参与病毒穿入、细胞融合和溶血等^［2］，它们在决定病毒的毒力和免疫应答等方面起着极其重要的作用^［3，4］，已相继在痘病毒^［5］、禽痘病毒^［6］、火鸡疱疹病毒^［7］及杆状病毒^［8］中得到表达，免疫学试验均显示良好的免疫原性。

HVT是最近发展起来的新型载体，由于对鸡及其它动物均无致病性，使用安全，接种鸡体后病毒在鸡体内形成长达数周的病毒血症，且终生潜伏感染，可刺激机体产生较高的抗体水平并维持终生，接种一次即可获得终生免疫，同时HVT是预防马立克氏病(MD)的常规疫苗，因此，HVT作为构建禽用基因工程苗的载体，具有其它载体不可比拟的优点。目前，HVT已成为国内外研究病毒载体的热点，国外已成功地表达了多种禽病保护性抗原基因，国内在这方面的研究尚未见报道。本研究利用PCR技术对NDV强毒株Miyadera株HN基因进行人工修饰，利用HVT自身启动子成功地在我们新构建的HVT载体中(HVT载体的构建将另文报道)得到有效表达，为国内ND基因工程疫苗的研究奠定了基础。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1病毒和细胞

HVT FC126株，按常规方法在SPF鸡胚成纤维细胞(CEF)上增殖，并从感染细胞中提取基因组总DNA，用于共转染实验。

1.1.2质粒与宿主菌

含NDV Miyadera株HN基因开放式阅读框的质粒M₆B₁₂，由中国农科院哈尔滨兽医研究所曹殿军博士惠赠；插入载体pTK₂B由作者构建；pUC19和宿主菌JM109为本室保存。

1.1.3工具酶及试剂

工具酶与兔抗鸡IgY-HRP结合物购自Promega公司，地高辛试剂盒购自宝灵曼公司。

1.1.4PCR引物由中国科学院上海植物生理所合成。

1.2方法

1.2.1NDV HN基因的PCR扩增与克隆

1.2.1.1PCR扩增根据检索到的Miyadera株HN基因序列，利用Goldkey软件设计一对引物，恰能覆盖HN基因开放式阅读框，并分别在5′端加酶切位点Primer 1(32 mer):5′GGCAAAGCTTATCATGGACCGCACAGTTAACC3′; Primer 2(28 mer):5′TGAAGTCGACCCAGTTTGATTCTTGGCG3′。P₁划线部分为Hind Ⅲ酶切位点，P₂划线部分为SalⅠ酶切位点，前面为保护碱基。按常规方法进行PCR扩增。

1.2.1.2PCR扩增片段的克隆及鉴定取适量PCR产物分别用HindⅢ和SalⅠ在相应buffer中进行双酶切，1%琼脂糖电泳，分离纯化1.8kb的条带。按常规方法克隆入pUC19中，将插入HN基因的重组体质粒命名为pHN。

1.2.2表达NDV HN基因转移载体的构建

取适量pTK₂B重组质粒用NheⅠ消化，加入dNTP和由pHN中分离、纯化的HN开放式阅读框，补平连接，转化于JM109中。挑取单个菌落，碱裂解法快速提取质粒，酶切后电泳鉴定HN基因是否插入及插入方向，符合要求者命名为pTKHN。

1.2.3表达NDV HN基因的重组HVT的筛选与纯化

1.2.3.1NDV HN基因探针的制备取10～20μg含NDV HN基因的质粒pHN，用HindⅢ和SalⅠ充分消化，经低熔点琼脂糖回收1.8kb片段溶于适量水中，按试剂盒说明用地高辛标记。

1.2.3.2共转染和重组体HVT的筛选^［9］用磷酸钙沉淀法，将3μg BamHI线性化的pTKHN质粒DNA与20μg HVT总DNA一起转染新鲜制备的CEF细胞，37℃ 5%CO₂培养6～7d，当出现大量细胞病变时，收获细胞，-20℃冻融3次，低速离心除去细胞碎片，上清作为检查重组病毒的材料，10倍递增稀释，分别感染于24孔培养板上已长成单层的CEF。当出现单个分散的病毒蚀斑时，覆盖营养琼脂，凝固后，翻转培养至出现大量单个病毒蚀斑。挑取单个蚀斑，于24孔培养板上扩大培养，当出现大量病变时，收获细胞，-20℃冻融3次，离心取上清，按常规方法进行斑点杂交试验。

1.2.4SDS-PAGE电泳及Western blot分析

将杂交阳性的重组体分别感染CEF扩大培养。收获的感染细胞用裂解缓冲液裂解后，与等体积2×SDS凝胶加样缓冲液混合，煮沸10min，在10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上电泳，电泳后用考马斯亮蓝染色观察。

将SDS-PAGE分离的蛋白转印到硝酸纤维素(NC)膜上，用1%BSA缓冲液(0.15mol/L NaCl，0.05mol/L Tris-HCl pH7.5)封闭2h，然后分别用鸡抗NDV高免血清(1∶100稀释)和HRP标记的兔抗鸡IgY(1∶2000稀释)室温作用2h。充分洗涤后，用DAB(二氨基联苯胺)和H₂O₂显色。

1.2.5表达NDV HN蛋白的重组体HVT的生长特性

将重组体HVT在CEF中连续传代10代以上，观察重组体HVT在CEF上的病变形态，并与亲本HVT病毒进行比较。

2结果

2.1PCR特异性扩增HN基因

采用1%琼脂糖电泳分析PCR产物，可见扩增产物在1.9kb和1.58kb之间出现单一的条带(图1)，表明我们的PCR方法特异地扩增了预定大小的靶片段。为了检查扩增片段两端所加酶切位点是否有效，我们对扩增片段进行了克隆。通过酶切和电泳分析表明所加酶切位点有效，对HN基因的人工修饰是成功的(图2)。对克隆阳性的重组质粒，用HindⅢ和SalⅠ酶切，能切出1.8kb的HN基因和2.69kb的pUC19载体两个片段，SalⅠ可将pHN线性化为4.49kb的片段。

图1PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳

Fig.1 PCR amplified products

eletrophoresed with 1% agarose gel

A:λDNA/EcoRI+HindⅢ Markers

B: PCR amplified products

图2pHN的酶切分析

Fig.2 Restriction pattern of pHN

A:λDNA/EcoRI+HindⅢ Markers

B:Digested with HindⅢ+SalⅠ

C:Digested with SalⅠ

2.2含NDV HN基因转移载体的构建

将修饰过的HN基因平端插入pTK₂B中的NheⅠ位点，通过筛选，获得两个重组质粒pTKHN₁和pTKHN₂。<