摘要根据汉坦病毒H8205株NP基因的序列，设计一对引物，扩增NP前292个氨基酸多肽基因片段，克隆于表达载体pGEX-3X，与载体中26kD的谷胱苷肽巯基转移酶(GST)融合表达。SDS-PAGE显示表达产物(GST-NP)主要以包涵体形式存在。Western-blotting表明此融合蛋白有抗原性。包涵体经分离、洗涤、溶解后，Sepharose 6B层析纯化，用此融合蛋白作抗原，进行ELISA法检测临床HFRS病人标本的IgG和IgM，有很好的特异性和敏感性。有生物活性的汉坦病毒H8205 NP的体外表达成功，为汉坦病毒基因工程抗原的大量制备奠定了基础，也为汉坦病毒的临床检测和流行病学调查提供了一种廉价、安全、可靠的抗原。

Expression of theS genome segment of HantavirusH8205 and

Application of the Expressed Polypeptide for Diagnosis of HFRS

Shen Changxian Li Zhongduo Yang Ruifu Zhu Qingyu

(Institue of Microbiology and Epidemiology, Beijing 100850)

AbstractThe S genome segment encoding the nucleocapsid protein (truncated) of Hantavirus H8205 was amplified by PCR and cloned into the expression vector pGEX-3X and expressed in E coli. SDS-PAGE showed that the expressed fusion protein (GST-NP) was mainly in the form of inclusion body. The expressed protein was used as diagnostic antigen in solid-phase enzyme immunoassay. The assay was used to detect IgG-and IgM-antibody in sera of HFRS patients originated from different geographic regions of China. The results revealed highly sensitive and specific. The successful expression and application of recombinant nucleocapsid protein of Hantavirus provides cheap, safe and sensitive antigen for the diagnosis of HFRS in China.

Key wordsHantavirus, Recombinant nucleocapsid protein, Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)

汉坦病毒是负链、单股、RNA病毒，基因组由L、M、S三个片段组成，分别编码多聚酶(Polymerase)，胞膜糖蛋白(G1，G2)和核衣壳蛋白(NP)。S基因在汉坦病毒属中保守性高，其编码产物NP在病毒颗粒中含量高，免疫原性强，是用作HFRS的理想诊断抗原^［1］。肾综合征出血热(HFRS)是一种病情急、病死率高的急性传染病，病人的早期确诊是治疗的关键。国外已用重组NP做抗原检测病人血清特异性抗体^［2～5］，国内对S基因已分别在原核系统、杆状病毒系统和痘苗病毒中进行了表达和初步应用^［6，7］。本研究对人源汉坦病毒H8205株的S基因部分片段进行表达，以便用于汉坦病毒的血清学诊断。

汉坦病毒H8205株是1982年李钟铎自我国东北一HFRS病人血清中用Vero E6细胞直接分离的毒株，同国内大部分省市的HFRS病人血清都可发生很强的免疫学反应，采用该株的NP做抗原，能较好地诊断流行于中国的汉坦病毒^［8，9］。本研究根据H8205株病毒的S基因的序列，把NP前292氨基酸的片段克隆于表达载体pGEX-3X，Western-blotting和ELISA试验证明表达产物的抗原性好和特异性强，对汉坦病毒抗原性研究及用于HFRS血清学诊断具有一定的理论与实用价值。

1材料与方法

1.1材料含汉坦病毒H8205株S基因NP编码区的克隆质粒pUC19/HTNS由本室构建，表达质粒pGEX-3X为本室保存。内切酶EcoRⅠ、BamHⅠ、T4 DNA Ligase(连接酶)、CIP(去磷酸化酶)均购自Promega公司，HFRS病人血清分别从山东、河北、陕西和浙江等地肾综合征出血热病人采集，HFRS阴性血清由解放军307医院提供，抗人IgG-McAb-HRP及抗人IgM-McAb-HRP由本室自制。

1.2目的基因的扩增根据汉坦病毒H8205株S基因NP编码区的序列，设计一对引物(引物序列见结果)扩增H8205株S基因前876bp片段。提取质粒pUC19/HTNS，然后PCR扩增：95℃3min，94℃ 1min，60℃1min，72℃2min，进行30个循环。最后72℃延伸10min^［2，4］。

1.3表达质粒pGEX-3X/HTNS的构建PCR产物纯化后EcoRⅠ酶切，连接于表达质粒pGEX-3X的EcoRⅠ位点，与载体中26kD的谷胱苷肽巯基转移酶(GST)融合表达^［10］。此质粒命名为pGEX-

3X/HTNS。

1.4融合蛋白GST-NP诱导表达质粒pGEX-3X/HTNS转化大肠杆菌DH5α，IPTG诱导表达，SDS-PAGE电泳确定融合蛋白GST-NP的表达形式，Western-blotting测定表达产物的抗原性^{［3，4，10］}。

1.5融合蛋白GST-NP纯化及复性融合蛋白GST-NP的诱导表达后，对包涵体进行提取、洗涤和溶解，Sepharose 6B凝胶层析纯化。

1.6ELISA检测HFRS病人血清标本抗体IgG和IgM纯化后的GST-NP蛋白适当稀释后4℃包被过夜，1%小牛血清封闭，依此加病人血清和抗人-IgG-McAb-HRP或抗人IgM-McAb-HRP，以空白对照调零，测波长495nm处OD值^［1，3］。

2结果

2.1汉坦病毒H8205株核衣壳蛋白基因的亚克隆

汉坦病毒H8205株NP基因序列的计算机分析，发现其抗原决定簇主要位于NP的N端(33～42)(待发表)，据此我们合成一对引物PH03-PH04，扩增H8205株NP前292个氨基酸的核苷酸片段，引物PH03：5′GCGAATTCGATGGCAACTATGGAGGAATTA 3′，引物PH04：5′GCGAATTCTGCATGCTGGCGTA 3′，5′端都含EcoRⅠ酶切位点，扩增的核苷酸片段为876bp(图1)。以克隆质粒pUC19/HTNS为模板进行PCR扩增，1.0%琼脂糖回收876bp的特异带，EcoRⅠ酶切后连接到相同酶切的表达质粒pGEX-3X的EcoRⅠ克隆位点。转化受体菌DH5α，挑选平板上生长的菌落作PCR及BamHⅠ酶切鉴定(图2)。此克隆质粒命名为pGEX-3X/HTNS，其构建过程见图3。

图1H8205株NP基因PCR扩增结果

Fig. 1 Amplification of the S genome segment of HantavirusH8205 by PCR with the primers PH03-PH04

1. Amplified product2. DNA markers: PCR marker

图2表达质粒pGEX-3X/HTNS的酶切鉴定

Fig.2 Restriction endonuclease analysisof pGEX-3X/HTNS

1. Vector pGEX-3X2. Negative direction pGEX-3X/HTNS/BamHI

3. Positive direction pGEX-3X/HTNS/BamHI4. DNA markers: λ DNA/BstEII

图3表达质粒pGEX-3X/HTNS的构建

Fig.3 Construction of expression plasmid pGEX-3X/HTNS

2.2融合蛋白的表达

表达质粒pGEX-3X/HTNS转化E.coli DH5α，工程菌经IPTG诱导后，取1mL表达菌体，以及含pGEX-3X载体经IPTG诱导和未经诱导的菌体各1mL，加入100μL SDS加样缓冲液煮沸3min，离心后进行SDS-PAGE。SDS-PAGE显示，工程菌在分子量58kD处出现一条新增蛋白带(GST-NP)，与预期的结果相符。经IPTG诱导的空载体菌则出现一条分子量为26kD的GST蛋白带，取菌体破碎离心后的沉淀和上清进行SDS-PAGE显示，表达蛋白以可溶性蛋白和不可溶性蛋白两种形式存在，但大部分以包涵体形式存在(图4)。

图4表达产物GST-NP融合蛋白SDS-PAGE电泳

Fig.4 SDS-PAGE of fusion protein GST-NP

1．DH5a-pellet2．DH5a-supernatant3．7．pGEX-3XHTNS-pellet4．8．pGEX-3X/HTNS-supernatant5．pGEX-3X-pellet6．pGEX-3X-supernatant10．proterin markers

2.3Western-blotting测定表达产物的的抗原性

诱导后的工程菌菌体出现一条带，空载体菌则未出现特异带(图5)。

图5表达产物GST-NP融合蛋白Western-blotting

Fig.5 Western-blotting of fusion protein GST-NP1.2. GST-NP 3.4. GST

2.4酶联免疫吸附试验(ELISA)

以融合蛋白GST-NP和GST分别作抗原，ELISA检测HFRS、森林脑炎和正常人血清的抗体IgG。结果表明，以GST作抗原，其OD值都为阴性；以融合蛋白GST-NP作抗原，HFRS为阳性，而森林脑炎<