摘要根据已发表的序列，分别在鸡贫血病毒(CAV)环形基因组DNA(全长2.3kb)的EcoRI位点和BamHI位点的两侧选择适当序列合成两对引物，用PCR技术，从斑点杂交检测到病毒核酸的CAV感染的MDCC-RP1细胞基因组DNA中，分别扩增出包含EcoRI和BamHI分割开的病毒基因组两部分(1.5kb和0.8kb)约1.5kb和约1.25kb的两个片段。再将其中相应序列拼接克隆进pUC18载体，获得包含CAV全基因组序列DNA片段的克隆质粒pCAV2.4。酶切分析表明，该质粒具有预期的BamHI位点、PstI位点、HindⅢ位点，而预期的EcoRI位点消失。重组质粒插入DNA片段的两端序列分析表明，质粒pCAV2.4是包含CAV全基因组序列的重组质粒，插入DNA片段序列中的EcoRI位点序列发生了一个碱基突变。

Amplification and Cloning of Chicken Anemia Virus whole

genomic DNA by Polymerase Chain Reaction

Chen WeiminCui ZhizhongDuang Yuyou et al

(College of Animal Science and Veterinary Medicine, Yangzhou University, Yangzhou 225009)

AbstractBy two pairs of primers complementory to the published sequences at the both sides of EcoRI site and BamHI site on CAV circular genome, two DNA fragments containing two parts (1.5 kb and 0.8 kb) of CAV genome divided by EcoRI and BamHI sites were amplified by PCR from the circular CAV genome (2.3 kb) detected by dot blot in genomic DNA of CAV-infected RP1 cells. Through re-ligation of the selected sequences from the amplified fragments, the whole CAV genomic DNA was cloned into pUC18, and the recombinant plasmid was designated as pCAV2.4. Restriction endonucleases analysis of pCAV2.4 showed that there were sites of BamHI、PstI、HindⅢ，but no site of EcoRI. Two ends of cloned DNA sequence analysis showed that the recombinant plasmid pCAV2.4 containes the whole genomic DNA sequence of CAV, and that the site sequence of EcoRI in the cloned DNA was changed by one base substitution.

Key wordsChicken anaemia virus, Genome, PCR, Clone

自Yuasa等^[1]报道鸡贫血病毒(CAV)以来，世界各地均陆续证明了该病毒感染的普遍性。CAV属于一个新的病毒科——圆环病毒科^[2]。这是一种无囊膜的呈二十面体的小病毒，直径只有20nm左右。CAV的基因组是一条只有2.3kb的单股环状“-”链DNA^[3]，只产生一个转录子，可编码三个蛋白质，即衣壳蛋白VP1及其相关蛋白VP2、细胞凋亡因子VP3^[4]。CAV的致病性在于通过CAV编码产生的细胞凋亡因子造成的细胞程序性死亡^[5]，主要是造血细胞和淋巴细胞的程序性死亡，进而造成感染鸡的贫血，出血及免疫抑制。在野外，感染CAV几乎不引起典型的临床症状，但由于CAV的免疫抑制作用，CAV感染群易并发或继发其它疾病，以及常引起疫苗免疫失败等情况。CAV的亚临床感染严重影响着养禽业的经济效益^[6]，然而至今仍没有理想的预防CAV感染的方法。国外将CAV基因组双拷贝串连在一起克隆进载体质粒后，所得到的重组质粒DNA转染MDCC-MSB1细胞后可产生传染性的CAV^[7]。这就有可能用基因工程的方法构建出能在体内复制的无致病性CAV毒株。为了尝试构建这样的毒株用作疫苗株，本研究用PCR技术成功地扩增和克隆了鸡贫血病毒全基因组DNA。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1 引物引物1：5′CATGATGAATTCCGAGTGGTTACTA3′

引物2：5′CATGATGGATCCCTCATTCTTAGTG3′

引物3：5′CATGATCGCCAAGATCTCTGTGAACCTG3′

引物4：5′CATGATGCATGCGAGCGAAGTCGAGCGATTCGTCCA3′

引物1和引物2分别对应于Noterborn等^[10]发表的CAV环形基因组DNA序列的1～19及互补链的1512～1494序列，用于扩增CAV环形基因组1～1512间1512bp DNA片段。两引物5′端分别具有EcoRI、BamHI酶切位点序列。

引物3和引物4分别对应于Noteborn等^[10]发表的环形基因组DNA序列的1158～1179及互补链的82～58序列，用于扩增CAV环形基因组1158～82间的DNA片段。引物4的5′端人为添加有SphI酶切位点序列。

1.1.2细胞及病毒

MDCC-RP1细胞系，由本教研室提供；CAVCux-1株，由中国兽医监察所惠赠。

1.1.3菌株及质粒

大肠杆菌TG1用作质粒转化的受体菌，pUC18质粒用作克隆的载体。二者皆由本教研室保存提供。

1.1.4分子生物学试剂

Dig DNA labeling and Detection Kit、PCR Kit、连接酶及各种限制性内切酶等均购自商业化公司，CAV VP1基因质粒^[9]由本教研室提供。

1.2方法

1.2.1CAV感染MDCC-RP1基因组DNA的制备

以含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液培养MDCC-RP1，CAV Cux-1株感染后，每48h自传一次，分别收集第7、14、19、26代细胞和未接种病毒的RP1细胞，按常规^[7，8]提取细胞基因组DNA。

1.2.2斑点杂交比较CAV感染的MDCC-RP1各代细胞中的病毒核酸的水平

对提取的各代细胞基因组DNA浓度定量后，以一系列已知浓度梯度的CAV VP1基因克隆DNA作为参考，用狄高辛标记的CAV VP1基因作为探针。在斑点杂交中检测和比较CAV感染后各代细胞中的CAV DNA水平。

1.2.3PCR扩增

引物1和引物2，引物3和引物4组成两对上下游引物，分别用于扩增包含CAV环形基因组EcoRI和BamHI分割开两部分的两DNA片段，1.5kb及1.25kb片段。其PCR扩增步骤基本一致，即：100μL反应体积中，模板DNA 46ng，引物浓度各为2.5μmol/L,4种dNTP浓度为200μmol/L，10×buffer组成为100mmol/L Tris(pH8.3),500mmol/L KCL,15mmol/L MgCl₂。反应混合液98℃变性10min,在室温下退火的同时迅速加入1μL Taq DNA聚合酶，覆盖液体石蜡油100μL，离心数秒，进入PCR循环： 94℃ 60s-55℃ 60s-72℃ 180s，共30个循环，最后一个循环后72℃再延伸10min。取PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳，以λDNA/HindⅢ消化物为标记物，观察扩增片段长度。

1.2.41.5kb PCR产物的克隆及重组质粒的酶切分析

将已纯化的1.5kb PCR产物与载体pUC18分别用EcoRI、BamHI双酶消化，低熔点琼脂糖电泳回收后，按常规^[8]连接、回收。挑取若干单个白斑，进行质粒扩增、提纯，以EcoRI、BamHI双酶切筛选出重组克隆。对重组质粒分别用EcoRI+BamHI、HindⅢ、PstI等内切酶进行酶切，验证插入片段内部酶切位点是否符合预期的结果。

1.2.5两PCR扩增片段相应部分的拼接克隆及重组质粒的酶切分析

将已纯化的1.25kb PCR产物与获得的1.5kb PCR产物的重组质粒分别用BamHI、SphI酶消化后，低熔点琼脂糖电泳后，分别回收0.9kb、4.2kb大小的片段，按常规^[8]连接转化。挑取若干单个白斑，分别进行质粒扩增、提取，酶切分析，筛选出包含2.4kb插入片段的重组质粒。对筛选到的重组质粒进一步用EcoRI、BamHI、PstI酶切分析。

1.2.6包含CAV全基因组的重组质粒中插入片段的两段序列分析

采用双脱氧法。整个测序过程由中国科学院上海植物生理所完成。

2结果

2.1斑点杂交比较CAV感染后的各代细胞中CAV DNA水平

以CAV的VP1-pUC18狄高辛标记探针检测CAV感染MDCC-RP1后各代细胞基因组中CAV DNA水平，结果表明： 自传7代的细胞中CAV DNA水平最高，杂交反应呈阳性，而自传14代，19代，26代以及未感染CAV的RP1细胞基因组DNA杂交反应呈阴性。以一系列已知含量的VP1-pUC18克隆DNA阳性样品对照作参考，表明探针的灵敏度可达1～10pg，估计自传7代的细胞基因组DNA每4μg约含50～100pg左右的CAV DNA(图1)。

图1斑点杂交检测CAV感染的MDCC-RP1各代细胞中CAV核酸

Fig.1Detection of viral DNA in MDCC-RP1 cells infected with CAV by dot blot hybridigation

B5,B6,A1,A2: 4μg genomic DNA of infected cells respectively in 7th, 14th, 19th, 26th passage; A3:4μg genomic DNA of RP1 cells; A4-A6: lng, 100pg, 10pg, 1pg,100fg, 10fg VP1-pUC18 DNA

2.2两对引物的PCR产物电泳结果

PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳显示： 以CAV感染RP1后自传第7代细胞基因组DNA为模板，引物1和引物2扩增出约1.5kb的条带，与预期长度1512bp一致；引物3和引<