摘要采用PCR定点突变方法，成功地构建了抗HBsAg dsFv抗体的轻、重链突变基因，NdeI和EcoRI酶切后分别插入pET20b表达质粒，经测序证明在重链第44位氨基酸和轻链第100位氨基酸已突变形成半胱氨酸(Cys)。VH和VL重组质粒分别转化到大肠肝菌BL21(DE3)中，IPTG诱导后，经SDS-PAGE电泳表明在12kD处有包含体蛋白表达，表达蛋白含量分别为28%和35%。VH和VL包含体蛋白经GuHCl变性后，等量混合在复性折叠液中结合，形成了一个约24kD并有一定活性的dsFv蛋白。抗HBsAg dsFv抗体表达及复性的成功，为今后基因工程抗体的研究及应用奠定了基础。

Construction, Expression and Folding of dsFv

Mutated Gene of Human Antibody to HBsAg

Song Hongbin Mao Chunsheng Chen Wei Du Yong Xu Dezhong Wang Haitao

(Department of Epidemiology, The Fourth Military Medical University, Xi′an 710032)

AbstractThe mutated gene of dsFv to HBsAg by PCR-based point mutagenesis method was constructed and sequenced. The mutated genes of VH and VL were cloned into plasmid pET-20 b and sequenced with the dideoxynucleotid method. The results showed that the cysteines were introduced into position 44 aa of VH and position 100 aa of VL. The recombinaint plasmids of VH and VL which were transformed into E.coli BL21 (DE3) separately produced a 1.2 kD inclusion body protien upon induction with IPTG. The expression level of VH(and VL) protein was 28% (and 35%). VH and VL inclusion bodies were solubilized and combined in equal molar ratio in the refolding solution. Then, VH and VL were folded into a 24 kD protein—anti-HBs dsFv which showed strong binding to HBsAg. These have laid a fundation to apply the dsFv against hBsAg.

Key wordsDsFv, HBsAg, PCR-based point mutagenesis method, Expression

二硫键稳定性Fv抗体(disulfide stabilized Fv fragments, dsFv)，是通过在重链的可变区(VH)和轻链的可变区(VL)之间形成二硫键来稳定Fv片段。和相应的ScFv相比，dsFv的稳定性和亲和力都得到很大提高，并且也具有象ScFv小分子的优势，所以dsFv和dsFv-免疫毒素在临床上具有很高的应用价值。自1990年 Glockshuber等^[1]第一次成功构建MCP603 dsFv抗体以来，dsFv及dsFv-免疫毒素的研究得到了突飞猛进的发展。我们采用Jung等^[2]预测的通用突变位点，即重链的第44位氨基酸和轻链的第100位氨基酸(简写为VH44/VL100)，应用PCR定点突变方法，成功地构建了抗HBsAg dsFv轻、重链的突变基因，并分别在大肠肝菌中进行了表达，表达蛋白还正确还原折叠形成了dsFv蛋白，现将结果报告如下。

1材料和方法

1.1质粒模板质粒是带有抗HBsAg Fab噬菌体抗体轻、重链基因的载体为本室构建，表达质粒pET-20b购自于Novagen公司。

1.2引物为将质粒中Fd基因突变成dsFv VH基因，设计了如下引物：

VH5：5′-GCGGAATTGTGAAACTGCTCGAACAGTCTGG-3′(位于1～23bp，划线处为NdeI酶切位点)

VHM：5′-TCCCATCCACTCAAGCTGTCCAGGGGCCTGTCGCACC-3′(位于108～147bp,划线处为突变位点)

VH3：5′-CGGCATTATGACGAGACGGTGACCGTGGT-3′(位于340～360bp，划线处为EcoRI酶切位点)

为将质粒中K链基因突变成dsFv VL基因，设计了如下引物：

VL5: 5′-GCGGAATTCGAGCTCGTGATGACCCAGT-3′(位于1～19bp，划线处为NdeI酶切点)

VL3: 5′-GGCATTAAGTTCGTTTGATTTCCACCTTGGTCCCGCCGAACGTCC-3′(位于293～333bp，划实线为EcoRI酶切位点，划虚线处为突变位点)

VH和VL氨基酸位置(VH44/VL100)的选择，依据文献[3]。

1.3构建dsFv VH突变基因的方法采用Mega-primer PCR方法^[4]。先用引物VH5和VHM以带有Fd基因的质粒为模板进行第一轮PCR：质粒DNA 5ng，引物VH5和VHM各0.4μg，Taq酶2u，dNTP 1μL，10×buffer 5μL,加水至50μL：扩增条件：94℃变性5min，然后94℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 1min,30个循环，72℃ 3min。PCR产物采用低熔点胶纯化回收，溶于50μL TE中。以此纯化的PCR产物为Mega-primer引物(VH5-M)进行第二次PCR：质粒DNA 1μg,引物VH5-M 3μg,引物VH3 0.4μg,Taq酶2u，dNTP 1μL,10×buffer 5μL，加水至50μL；扩增条件：94℃变性6min，然后94℃ 2min、55℃ 1min、72℃ 1min,循环30次，72℃ 5min。扩增产物均在2%琼脂糖凝胶电泳，254nm紫外灯下观察粉红色条带。采用第二次PCR产物进行测序。

1.4构建dsFv VL突变基因的方法采用常规PCR方法：质粒DNA 5ng，引物VL5和VL3各0.4μg，Taq酶2u，dNTP 1μL,10×buffer 5μL，加水至50μL，扩增条件同1.3第一次PCR。

1.5突变基因的序列测定VH和VL的PCR产物用NdeI和EcoRI双酶切，低溶点胶纯化回收后，与经NdeI和EcoRI双酶切的pET-20b载体连接，转化XL-1 blue细胞，用T7 promoter和T7 terminater引物进行双脱氧末端终止法测序。

1.6VH和VL蛋白的表达将上述1.5制备的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，用PCR法鉴定阳性克隆。将含重组质粒的单个菌落置于2mL LB培养液(Amp 100mg/mL)中，37℃ 振摇过夜。第二天，分别取30μL菌液转种于2mL LB培养液(Amp 100mg/mL)中，37℃振摇3～4h至OD₆₀₀=0.6～1.0，加IPTG至0.4mmol/L，继续振摇3h。诱导后菌液6000r/min离心10min，弃上清，加100μL 1×上样缓冲液，95℃水浴5min，12 000r/min离心1min。取上清加样于SDS-PAGE电泳，考马氏亮兰染色，脱色后观察结果。SDS-PAGE凝胶在双薄层扫描仪(Shimadzu CS-930)检测蛋白表达含量。

1.7VH和VL包含体蛋白的分离50mL菌液按上述1.6进行诱导表达，6000r/min离心5min，弃上清，沉淀用5mL 50mmol/L Tris-HCl pH8.0, 2mmol/L EDTA悬浮，加溶菌酶至100μg/mL及0.5mL 1% Triton X-100,30℃水浴15min。置冰上，超声波粉碎细胞，4℃,12 000r/min离心15min。上清包含可溶性蛋白，取50μL加等量2×上样缓冲液；沉淀包含水不可溶蛋白，加100μL 1×上样缓冲液，加样于SDS-PAGE电泳，考马氏亮兰染色，脱色后观察结果。

1.8VH和VL蛋白折叠形成dsFv蛋白VH和VL包含体分别在GuHCl变性缓冲液中溶解，然后混合加入折叠缓冲液(0.1mol/L Tris。HCl, 0.5mol/L L-arginine, 8mmol/L GSSG, 2mmol/L EDTA)中，10℃温育24～36h，VH和VL折叠、结合形成dsFv。取折叠液100μL，加1×上样缓冲液(不含β-巯基乙醇)，加样于SDS-PAGE电泳，考马氏亮兰染色，脱色后观察结果。具体方法参见文献[5]。

1.9dsFv蛋白的纯化及活性检测10kD和30kD超滤柱均购自美国Amicon公司。取10mL折叠液加入30kD超滤柱，4℃，4000r/min离心4h，去除未折叠的VH和VL，然后把未滤过的液体转入10kD超滤柱，4℃， 4000r/min离心4h，进行浓缩。取100μL浓缩后的折叠液进行SDS-PAGE电泳，观察纯化结果。以2μg/mL的抗HBsAg的dsFv蛋白包被ELISA板孔，4℃过液，2%BSA封闭，分别加入适量的HBsAg和HCVC区重组抗原，再加入酶标抗HBsAg和酶标抗HCV，以底物邻苯二胺显色，在495nm处测定吸光值(OD₄₉₅)，重复三次计算其平均值。

2结果

2.1测序结果

VH和VL的PCR产物与pET-20b载体连接，转化XL-1 blue细胞后，用T7 promoter和T7 terminater引物进行双脱氧末端终止测序。VH和VL的序列分别见图1和图2。

Sequence:VH Length:381

图1抗HBsAg dsFv抗体重链可变区的基因序列及推导的氨基酸序列

Fig.1DNA and deduced amino acid sequences of VH of dsFv against HBsAg

Sequence:VL Length:372

图2抗HBsAg dsFv抗体轻链可变区的基因序列及推导的氨基酸序列

Fig.2 DNA and deduced amino acid sequences of VL of dsFv against HBsAg

从VH和VL序列，我