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cDNA Synthesis, Cloning and Partial Nucleotide Sequence
of Grass Carp Hemorrhage Virus (GCHV)
Tian JingZou GuipingFangQin(Wuhan Institute of Virology, Academia Sinica, Wuhan 430071)
AbstractGrass Carp Hemorrhage Virus (GCHV) was purified from infected fish cell culture by using different centrifugation. Its total genome was isolated by proteinase K treatment following phenol/chloroform extraction. The individual segment of GCHV-dsRNA was separated by running 1% agarose gel electrophoresis and recovered by Gel Extraction Kit. Each segment was denatured in 90% DMSO by heating at 70℃ for 15min. The cDNAs of several segments were synthesized with random hexamers method and cloned into EcoRV site of pZErO 2.0 vector, then transformed into TOP10 E.coli competent cell by electroporation transformation. It was showed that the recombinant plasmids contained GCHV-RNA genome of interest by dot hybridization besides both restriction analysis and PCR amplification. The partial DNA sequence of GCHV segment 11 was analysed.
Key wordsGrass Carp Hemorrhage Virus, cDNA cloning, cDNA sequence
草鱼出血病病毒为我国分离的第一株鱼类病毒，近年来的研究结果表明，该病毒为呼肠孤病毒科一新成员[1]。根据对该病毒的体外转录及转译研究，证实该病毒含内源RNA聚合酶[2]，其病毒基因组具有mRNA的性质[3]。多肽的基因定位[4]结果表明，各基因片段与其编码的病毒多肽基本呈对应关系。为进一步了解该病毒的分子生物学性质、弄清各基因片段的结构与功能以及内在联系，我们对该病毒基因组进行了cDNA合成、克隆及序列分析，现将结果报道如下：
1材料与方法
1.1材料
1.1.1细胞与病毒毒株
实验所用细胞为鱼肾CIK细胞系，病毒材料为本实验室分离的GCHV873毒株[5]。
1.1.2试剂
cDNA合成试剂盒及一些酶类购自BRL公司。PCR扩增试剂及Taq酶为Perkin Elmer产品。克隆试剂盒购自Invitrogen公司。柱离心式胶回收试剂盒及PCR纯化试剂盒为华舜公司产品(上海)。32P系列产品购自亚辉生物公司(北京)。限制性内切酶类为华美公司产品。DNA测序试剂盒为Epicentre Technologies产品。
1.2方法
1.2.1病毒分离及基因组纯化
感染病毒的细胞悬液用差速离心方法[5]进行分离。纯化的病毒粒子经100ng/mL蛋白酶K及0.1%SDS消化后，用酚—氯仿提取病毒核酸。纯化的病毒核酸经1%琼脂糖凝胶电泳分离，紫外灯下切下各电泳条带，采用胶回收试剂盒进行各片段的纯化。纯化后的各基因片段经无水乙醇沉淀后，溶于少量无RNA酶的双蒸水中，于-20℃保存备用。
1.2.2病毒基因片段的cDNA合成
取纯化的病毒基因片段2μg溶于10μL 90%DMSO中，70℃加热15min使之变性。cDNA合成参考Cashdollar[6]等人的方法。用随机引物法引导合成cDNA第一链，然后用0.5mol/L NaOH 37℃保温30min，以降解RNA模板，再用HC1中和。通过PCR纯化试剂盒除去引物六聚体，50℃条件下使其两条链退火形成双链cDNA，最后用DNA Polymerase大片段将cDNA末端补平。
1.2.3cDNA克隆
各基因片段cDNA的克隆按克隆试剂盒指南进行。先用EcoRV酶解pZErO 2.0质粒，使其成为平头末端，与双链cDNA进行平头连接，电转化TOP10感受态细胞，电转化感受态细胞的制备按试剂盒指南进行。转化的细胞于SOC培养基中37℃保温30min后，涂布于含有Kanamycin(50ng/mL)的LB平板，37℃过夜培养。同时设置非重组质粒为阴性对照。
1.2.4重组质粒的筛选与鉴定
挑选单个菌落接种于2mL含Kanamycin的LB培养基中进行小量培养，用煮沸法快速制备质粒DNA[7]。琼脂糖凝胶电泳及双酶切鉴定重组子。同时利用质粒载体SP6及T7启动子位点引物进行PCR扩增。PCR扩增条件为94℃变性30sec,50℃退火1min,70℃延伸2min,循环35次。
1.2.5cDNA探针的合成及斑点杂交
采用缺口平移法标记克隆的cDNA片段，斑点杂交按分子克隆方法进行[7]。
1.2.6DNA序列分析
双链质粒DNA序列测定按Sequi Therm EXCELTM DNA测序试剂盒进行。
2结果
2.1草鱼出血病病毒基因片段的分离及纯化
GCHV-dsRNA在7% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中呈现11条带，按其电泳图谱的大小顺序可分为四组[1]。I组为1～3片段，Ⅱ组为4～6片段，Ⅲ组为7～9片段，第Ⅳ组为10、11片段。为获得足够量的GCHV-dsRNA单个片段，我们将提纯的病毒核酸在1%琼脂糖凝胶上进行电泳分离，然后采用胶回收试剂盒纯化回收的单一片段，得到了大于70%的回收率。由于大分子片段(1、2、3和4、5)在该电泳条件下(60mA,90min)不能彼此分开，故我们采用两轮胶回收分离纯化的方法以获得单一大分子片段。为检查其回收效果，将电泳回收的11条RNA片段与GCHV-dsRNA基因组同时进行电泳(60mA,90min),所得结果见图1。从图中可以看到，回收的单一片段的迁移率与基因组中对应的片段完全吻合，完整性很好。由于大分子片段1～3及4、5在短距离凝胶电泳条件下泳动率基本相同，故图中所示胶回收的1～3及4、5片段的迁移率无明显差别。
图1GCHV基因组及各片段的琼脂糖凝胶电泳
1，14：1kb DNA标准分子量；2：GCHV dsRNA；3～13：GCHV 各基因片段
Fig.1GCHV dsRNA and individual dsRNA segments in 1% agarose gel
2.2基因片段的cDNA合成
采用随机引物法反转录合成的cDNA第一链经碱降解RNA，HC1中和后，使分别以双链RNA为模板合成的两条互补的cDNA链退火形成双链DNA。图2显示随机引物法合成的第11片段cDNA。从图中可以看到其cDNA条带散布于400～850bp范围内，其上限区域基本与第11片段的分子量大小一致。由于随机引物法引导合成cDNA起始位点不同，故其产物由大小不同的片段组成。
图2GCHV第11片段(S11)的cDNA
A： 1kb DNA 标准分子量；B: 所合成的GCHV第11片段的cDNA
Fig.2cDNA synthesis of GCHV S11
A: 1kb DNA ladder;
B: Synthesized cDNA of GCHV S11
2.3重组质粒的酶切鉴定、PCR扩增及斑点杂交
重组质粒的酶切鉴定、PCR扩增及斑点杂交结果见图3(A、B、C)。图3A、3B显示通过双酶切及PCR扩增，得到的大小不同插入片段的重组质粒。采用32P标记的第11片段的cDNA克隆与GCHV基因组RNA及分离的单一的第11片段在68℃条件下进行点杂交，其结果为阳性。阴性对照无斑点出现。由此可见，实验所得的GCHV单一片段的阳性克隆为相应的目的基因片段。
图3重组质粒的酶切鉴定、PCR扩增及斑点杂交
3A.1：1kb DNA标准分子量2：线性化的pZErO 2.0质粒
3：超螺旋和线性化的pZErO 2.0质粒
4～5：BamHI和XhoI消化的第9片段(S9)的重组质粒
6～10：BamHI和XhoI消化的第6片段(S6)的重组质粒
