摘要：应用地高辛标记的对虾白斑杆状病毒（white spot syndrome baculovirus，WSSV）核酸探针，与人工感染后不同时间采集的对虾组织样品进行原位杂交，以动态研究病毒从侵染至对虾发病死亡的过程。将典型感染WSSV的病虾组织投喂健康对虾，结果显示：WSSV首先通过侵染消化道上皮进入虾体内增殖，此后随着细胞裂解、病毒粒子释放，游离的病毒粒子伴随血淋巴循环进而侵染其它靶组织，直至对虾发病死亡。

中图分类号：S945.4文献标识码：A

文章编号：1000－8721（2000）03-0242-05

Study of White Spot Syndrome Baculovirus Infection Process

in Penaeus Monodon by in situ Hybridization

HUANG Can-hua

（Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences， Wuhan 430027, China；Joint-laboratory of Invertebrate and Virology, Wuhan Institute of Virology, the Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430071, China）

SHI Zheng-li

（Joint-laboratory of Invertebrate and Virology, Wuhan Institute of Virology, the Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430071, China；UMR219, CNRS-IFREMER DRIM Place E. Bataillon, cp-80 34095 Montpellier, Cedex 5, France）

ZHANG Jian-hong，CHEN Di-hua

（Joint-laboratory of Invertebrate and Virology, Wuhan Institute of Virology, the Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430071, China）

ZHANG Lu-ping

（Southern Institute of Oceanology, the Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510034, China）

WU Xiong-fei

（Ningbo Fisheries Institute, Ningbo 315010, China）

J R Bonami

（UMR219, CNRS-IFREMER DRIM Place E. Bataillon, cp-80 34095 Montpellier, Cedex 5, France）

WU Qing-jiang

（Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences， Wuhan 430027, China）

Abstract: The tissue sections of artificially infected shrimp (Penaeus monodon) sampled at different times were hybridized in situ with digoxigenin (DIG)-labeled WSSV DNA probe in order to dynamically study the viral infection process in shrimp body. Feeding the healthy Penaeus monodon with diseased shrimp tissues which was confirmed to be typically infected with WSSV. The results showed that WSSV firstly infected and replicated in the epithelial cells of alimentary tract, the viral particles then released with the host cell lysis. The dissociative viral particles proceeded to infect other target tissues following hemolymph circulating in the shrimp body till the shrimp got diseased or died.

Key words: hybridization in situ; Penaeus monodon; white spot syndrome baculovirus (WSSV); infection process

对虾无包涵体杆状病毒或称之为对虾白斑综合征杆状病毒（white spot syndrome baculovirus，WSSV）是近几年来危害我国及亚洲太平洋地区人工养殖对虾的主要病毒病原之一^［1］。1993年曾引起人工养殖对虾暴发性流行病发生，迄今仍没有得到有效控制。有关该病毒的理化性质、人工回接感染、显微与超微病理、基因组克隆等均有较详细的报道^［2－4］。本文在前期工作基础上,拟采用地高辛标记的中国对虾WSSV基因组核酸片段作探针，对人工感染WSSV不同时间采集的对虾组织样品做原位杂交，动态反映对虾白斑杆状病毒在机体内感染至宿主发病死亡的过程，具体结果报道如下。

材料与方法

1毒源WSSV宁波株系1998年5月从浙江宁波采集的典型发病的中国对虾（Penaeus chinensis），深圳株为中科院南海所深圳大亚湾试验站人工感染保存的斑节对虾（Penaeus monodon）。

2人工感染实验人工感染实验在中国科学院科院南海所深圳大亚湾实验站进行。实验对虾为斑节对虾，体长10cm～14cm，从大亚湾东山珍珠场购买。实验前充气暂养3天。实验组（共4组，其中2组用于统计感染数据）第4天起投喂剪碎的典型病虾头部组织，对照组投喂颗粒饵料。实验组感染后按12h、24h、36h、72h采集样品，Davison＇sAFA固定液固定12～24h，样品转入70％乙醇中保存。

3核酸探针的制备核酸片段L46约1.5kb，来自中国对虾WSSV基因组，克隆进pUC18质粒中。含L46核酸片段的pUC18质粒经EcoRI酶切，0.7％琼脂糖凝胶电泳，Gel extraction kit（上海华顺）回收，地高辛试剂盒（Dig high primer labeling and detection kit，Boehringer Mannheim）标记^［4］。

4原位杂交前样品包埋处理样品经梯度乙醇脱水，80％、90％、95％、100％乙醇各2次、每次1h；Toluene（Sigma）2次,每次1h；样品透蜡2次,每次6～12h；然后用石蜡定向包埋。

5 原位杂交程序感染样品依Lightner方法进行包埋处理（Lightner1996）^［5］，切片厚度≤4μm，粘附在经多聚赖氨酸硅化的洁净玻片（polylabo）上，60℃融蜡30min，Toluene脱蜡。依次100％、95％乙醇各3次，每次5min；80％、50％乙醇水化（3×10dips）；双蒸水（ddH₂O）1min；37℃ 100μg／ml蛋白酶K处理30min；PBS漂洗2次（2×5min），4％冷甲醛固定10min；2×SSC漂洗1次，10min；每张玻片滴加500μl杂交液（50％甲酰胺，0.2％Ficoll 400，0.2％ polyvinlpyrrolidone，0.2％BSA，5×SSC，50mmol／L Tris－HCl pH8.0，1mmol／L EDTA），预杂交3h；42℃在含Dig探针10ng／ml杂交溶液的湿盒中杂交过夜。杂交结束后，玻片在室温下依次经2×SSC、1×SSC漂洗各2次，每次10min。42℃依次经0.5×SSC、0.1×SSC漂洗各2次，每次30min。

6杂交结果检测玻片经Buffer Ⅰ（100mmol／L Tris－HCl，150mmol／L NaCl pH7.5）漂洗5min，37℃ Buffer Ⅱ（含1％Blocking reagent的Buffer Ⅰ）溶液中阻断30min，BufferⅠ漂洗2次，每次15min。Buffer Ⅲ（100mmol／L Tris－HCl，100mmol／L NaCl，50mmol／L MgCl₂，pH9.5）室温平衡5min，BCIP－NBT显色0.5h～3h，0.1×TE终止反应。Eukitt封片，镜检，阳性信号呈明亮的兰紫色。

结果

1人工感染实验结果

WSSV宁波株和深圳株分别感染的斑节对虾，在感染3天后均开始出现死亡（图1）。试验1组为深圳人工感染选择保留的毒株，感染至第10天时累计死亡率达100％，半数死亡时间为6天；而试验2组为宁波野生毒株，感染3～7天对虾全部死亡，半数死亡时间为4天。对照组至第10天无一尾死亡，核酸探针检测呈阴性反应。从试验组结果来看，两株病毒感染宿主后半数致死时间差别较大，这种毒力差异是因为WSSV不同株系基因组之间存在差别，还是由于病毒反复感染后毒力减弱所致，目前还在深入研究之中。

图1两株对虾无包涵体杆状病毒人工感染斑节对虾实验结果

Figure 1Artificial infection of Penaeus monodon with 2 isolates of non－occluded baculovirus

Temperature：26－28℃；pH：8.1－8.3；

2原位杂交所见

采用Dig－标记的核酸探针对感染后不同时间的对虾组织样品进行原位杂交，不同组织受染情况见表1。图2a显示，感染36h后消化道上皮出现明显的杂交信号，但组织细胞结构尚完好，肝、胰腺、肝小管间隙血淋巴通过之处无杂交反应；同一对虾鳃上皮组织不被标记（图2b）。结果提示，WSSV侵染进入虾体首先是含病毒的虾组织经消化道研磨消化后，病毒粒子释放出来，通过侵染消化道上皮进入虾体细胞内增殖。病毒在细胞内增殖最终导致细胞裂解，游离的病毒粒子伴随血淋巴在虾体内循环进而侵染其它虾组织。感染48h后可以看到，在对虾肝小管之间血淋巴流经之处，鳃上皮组织开始出现明显的杂交信号（图2c、d）。随着感染时间的推移，杂交信号的强度加大（图2－e、f，感染60h后的结果）。感染72h后，消化道上皮、鳃上皮、甲壳下上皮、皮下及造血组织、淋巴器官均呈现深度标记(图2g－j)，对虾受染组织、细胞的大量坏死，直接导致对虾正常生理机能的紊乱，这与图1显示的对虾感染3天（72h）后出现死亡的结果吻合。对照组经核酸探针原位杂交检测呈阴性反应，组织细胞结构完整。

表1病虾组织原位杂交检测不同组织受感染情况

Table 1Infection of different tissues of Penaeus monodon after artificially fed with WSSV de