摘要：朊蛋白为可传播性海绵样脑病的感染因子。将编码朊病毒蛋白的PrP标准及突变DNA序列分别连接到真核表达载体pcDNA3.1中，并分别转入中国仓鼠卵巢细胞（CHO）。经过RT－PCR、RNA dot blot、Western blot鉴定证实，得到了稳定表达人标准（CHOs）和终止密码突变PrP基因（CHOm）的细胞系。对此细胞系进一步研究发现，带有标准人PrP序列的CHO细胞系的生长速度比其它对照细胞系为慢，但细胞周期无明显变化。用全反式维甲酸处理细胞后，CHOs细胞系呈现出Hoechest33258核质深染、DNA ladder电泳图形及细胞流式光度术分析凋亡细胞群和G1细胞亚群增加，而在同样的处理条件下对照细胞系未出现凋亡征象。这提示朊蛋白可能参与细胞程序化死亡的调控过程。

中图分类号：S852.65^＋9.7 文献标识码：A

文章编号：1000－8721（2000）03-0207-05

Expression of Human PrP Gene in CHO Induces the Features of Apoptosis

ZHAO Xia，DONG Xiao-ping，ZHOU Wei，HUNG Tao（Institute of Virology, Chinese Academy of Preventive Medicine, Beijing 100052, China）

Abstract: Prion is considered to be the infectious agent for the transmissible spongiform encephalopathy. The standard and mutated human PrP genes were separately inserted into an eukaryotic expression vector and transfected into CHO cell, respectively, generating CHOs strain containing the standard PrP gene and CHOm strain containing the mutated PrP gene. Analysis of the cellular DNA, RNA and protein revealed that the transfected human PrP gene was persistently transcribed and expressed in CHOs strain. During the passages, the CHOs cell line showed a slowly duplicating rate as compared with the mock, but the CHOc containing only expression vector and the CHOm showed not any changes of cell life cycles. After treatment with RA, the cell line CHOs showed deeply stained chromatin with Hoechst 33258. DNA ladder pattern in agarose gel electrophoresis and the flow cytometry both revealed clusters of apoptotic cells and increasing amount of G1 subgroup cells, whereas the other CHO cell lines failed to show any features of apoptosis. It suggests that human prion protein might play a role in controlling cell programmed death.

Key words: prion; gene transfection; CHO cell; cell apoptosis

朊病毒病（prion disease）或可传播性海绵样脑病（transmissible spongiform encephalopathy，TSE）为一组累及人、动物中枢神经系统致死性脑病。尽管病变性朊蛋白PrP^Sc是主要致病因子的观点被人们广泛接受，但对其正常异构体膜蛋白PrP^C的生物学功能了解甚少。有报道PrP参与淋巴细胞活化或作为某些神经细胞群的营养因子^［1］。PrP^C还可能在突触的正常功能中起一定作用^［2］。研究还显示，去除PrP基因的小鼠其发育和行为基本正常，因而推测PrP分子或许不是细胞正常生理功能所必需的^［3，4］。为了探讨朊蛋白的正常生理功能，我们构建了含有人PrP基因的真核表达载体，并将其转入中国仓鼠卵巢细胞（CHO），经过DNA、RNA、Western blot鉴定，得到了稳定表达人PrP基因的CHO细胞系。对此细胞系的进一步研究发现，它的生长速度比未转染的细胞慢，在细胞凋亡诱导剂全反式维甲酸的作用下发生凋亡征象。

材料与方法

1质粒构建以我们构建的人标准PrP（s）和点突变PrP（m）基因质粒^［5］为模板，进行PCR扩增。上游引物：5＇AAG CTTGCA GTC ATT ATG GCG AAC CTT GGC3＇（5＇端带有HindⅢ位点），下游引物：5＇GGA TCCTTA TCC CAC TAT CAG GAA GAT GAG G3＇（5＇端带有BamHI位点）。点突变PrP（m）基因在nt194位存在有中国汉族人群特有的G→A的突变，致使在65位氨基酸形成终止密码^［5］。PCR按常规法进行，反应条件为：94℃1min，58℃1min，72℃1min。将PCR扩增PrP片段连接到载体pGEM－T中，酶切、测序鉴定。用HindⅢ和BamHI游离克隆的PrP（s）和PrP（m）基因片段连接到载体pcDNA3.1中，构成质粒pcDNA3.1－PrP（s）和pcDNA3.1－PrP（m）。

2细胞培养和转染CHO细胞在含有10％小牛血清的DMEM培养液中生长。细胞转染按GIBCO BRL公司的LipofectAMINE Reagent试剂盒说明书进行。用含800μg／mlG418筛选抗G418的阳性细胞。将转染了质粒pcDNA3.1、pcDNA3.1－PrP（s）、pcDNA3.1－PrP（m）的细胞系分别命名为：CHOc、CHOs和CHOm。细胞DNA及RNA的提取按常规方法进行。

3RT－PCR1μg细胞RNA同1μl oligo（dT）18（0.1μg）75℃变性5min，自然冷却。加入0.5μl AMV（200μ／μl），1μl RNasin，4μl 2.5mmol／L dNTP，37℃作用1h。PCR反应同上，以5μl反转录产物为模板进行PCR反应。

4RNA dot blot将提取细胞总RNA各20μg点样于硝酸纤维素膜（Amersham公司）上，80℃烘烤2h。以³²P－标记的人PrP基因PCR产物作为RNA／DNA杂交探针，探针标记按随机引物标记试剂盒（Promega公司，Prime-α-Gene-labeling system）说明书进行。按照分子克隆所述方法进行杂交、洗膜。－80℃曝光72h，冲洗X－光片。

5Western blot按照《分子克隆》所述方法从培养细胞中提取总蛋白，Bradford法测定蛋白浓度。蛋白质电泳和免疫印迹按常规方法进行。

6生长曲线（MTT法）将细胞接种于96孔细胞培养板，浓度为2?500个细胞／孔。每24h取4个平行孔加入MTT使终浓度达到5mg／ml，37℃孵育4h。加脱色液处理1h以上，空白对照以DMEM培养液代替细胞悬液。在酶标光度仪上于570nm处测定OD值，每点取4个平等孔的平均值。总共测定120h。

7诱导凋亡将四种细胞按1×10⁵浓度分别传代，待细胞贴壁后48h，换成含有10μmol／L的全反式维甲酸（all－trans retinoic acid，RA）的培养液，继续孵育72～120h。

8流式细胞光度术取对数生长期或经RA诱导的细胞，加入适量的75％乙醇固定细胞24h。离心收集细胞，加入终浓度为50μg／ml的RNase，37℃消化30min。加65μg／ml的碘化丙啶染液作用1h，经尼龙膜过滤后，以标准程序用FACSan流式细胞光度计（Becton Dickinson公司）对细胞进行分析。

9Hoechest33258染色将细胞以1×10⁵浓度接种于盖玻片上，经全反式维甲酸诱导后，对细胞进行Hoechst33258染色。以343nm的紫外光激发，荧光显微镜下观察细胞内染色质的着色情况。

10DNA ladder的检测收集细胞，用150μl裂解缓冲液（1％NP－40，20mmol／L EDTA，50mmol／L Tis－HCl，pH7.5）处理10s。1?600g离心5min，收集上清重复抽提，合并两次抽提的上清。加入终浓度为1％的SDS，5μg／μl RNase A 56℃作用2h，蛋白酶K（终浓度为2.5μg／μl）37℃消化2h，乙醇沉淀DNA。1％的琼脂糖凝胶电泳检测。

结果

1真核表达载体的构建及其鉴定

PrP蛋白氨基酸序列为PrP基因的第二个外显子所编码^［6］。为了在真核细胞中表达人PrP蛋白并使其蛋白前体加工成为成熟的朊病毒蛋白，即带有信号肽并剪切掉羧基端的23个氨基酸，我们设计的引物位于第二个外显子的两端。PCR扩增后经琼脂糖凝胶电泳均在预期的759bp位置出现一条带。扩增片段连接到克隆载体pGEM－T中经测序证明其正确后，将PrP（s）、PrP（m）分别亚克隆入真核表达质粒pcDNA3.1，重组质粒经酶切分析以鉴定插入片段的性质和方向（结果未显）。

2建立了稳定表达PrP基因的CHO细胞系

提取细胞DNA进行了人PrP基因的扩增，在转染了人PrP基因的细胞系CHOs和CHOm中可扩增出一条约800bp的条带，而在相应的CHO细胞和转染了pcDNA3.1的空载体的细胞中无扩增条带出现（结果未显）。这表明我们建立的这两株细胞系带有人PrP基因。RT－PCR结果显示，在CHOs和CHOm细胞中可出现特异性扩增条带（图1a）。进一步采用RNA blot印迹方法，结果显示CHOs和CHOm细胞RNA中存在有阳性杂交斑点。这表明在CHOs和CHOm细胞系中有人PrP基因的转录（图1b）。

图1人PrP基因在4种CHO细胞系中的转录

Figure 1Transcription of human PrP gene in four CHO cell lines

A. Lane 1-4. RT-PCR; Lane 5-8. Direct PCR using the cellular RNAs as the templates; 1,5. cHOm; 2,6. CHOs; 3,7. CHOc; 4,8. CHO; 9. 1kb DNA ladder. B. Analyzed with RNA dot blot hybridization. 1. CHO; 2. CHOc; 3. CHOs; 4. CHOm.

提取细胞蛋白，用PrP蛋白特异的单克隆抗体3F4（Dr.Chen惠赠）进行Western blot检测。结果发现CHOs细胞中有一条约35kD的阳性蛋<