摘要：以该实验室分离并鉴定的牛泡沫病毒（BFV）中国毒株（BFV₃₀₂₆）为材料，用PCR方法首次克隆了位于env基因3′端的内部启动子，经序列分析后，引入luc基因作瞬时表达分析。结果表明，该内部启动子不但基础活性高于LTR，而且转录活性在Tas参与下被大大激活，其激活活性也远远高于LTR。同源分析表明，非灵长类泡沫病毒内部启动子之间的同源性高于其与灵长类泡沫病毒内部启动子之间的同源性。

中图分类号：S852.6⁺9.3; Q75 文献标识码：A

文章编号：1000－8721（2000）03-0227-05

Cloning and Functional Analysis of the Internal Promoter of a Bovine Foamy Virus

ZHANG Li，WANG shi-zhen，LIU Jia-jian，

lIU Shu-hong，CHEN Qi-min，GENG Yun-qi（College of Life Sciences, Nankai University, Tianjin 300071, China）

Abstract: Bovine foamy virus is a member of spumavirus that encodes three retroviral genes, gag, pol and env for virion proteins as well as additional open reading frames. ORF-1 was proven to be a viral transactivator which augmented transcription directed by the long terminal repeat (LTR) through cis-acting targets in the U3 domain of the LTR. Recently, we demonstrated by using sequence analysis and transient expression assay that a newly isolated BFV₃₀₂₆ strain also encoded an internal promoter (IP) in the 3' end of BFV env gene. Transcription directed by the IP of BFV was greatly activated by the ORF-1 in BL-12 cell line. Furthermore, both the basal activity and enhanced activity of IP were much greater than those of LTR, which suggests that different transactivation mechanisms were involved in regulating BFV LTR and IP.

Key words: Bovine foamy virus; env gene; internal promoter; long terminal repeat (LTR)

泡沫病毒（spumaviruses）在分类上属反转录病毒科（Retroviridae）的泡沫病毒属（Spumavirus）。泡沫病毒感染细胞后形成多核大细胞，即合胞体，并诱发细胞质形成空泡和内质网水肿，从而使被感染的细胞看似泡沫状，泡沫病毒因此得名。目前已从健康或患病的人、猴、猫、牛等体内分离到人泡沫病毒（human foamy virus，HFV）、猴泡沫病毒1、3型（simian foamy virus type 1、3，SFV－1、SFV－3）、猫泡沫病毒（feline foamy virus，FeFV）、牛泡沫病毒（bovine foamy virus，BFV）等。到目前为止有关泡沫病毒的研究大部分集中在HFV、SFV等灵长类泡沫病毒上，而对于非灵长类泡沫病毒，特别是BFV的研究还很不深入。BFV全序列近期才见报道^［1］，其基因组全长12．0kb，两端为1．30kb的长末端重复序列（LTR），中间部分除gag、pol、env三个结构基因外，在env与3′LTR之间有两个重叠的开放阅读框架ORF－1和ORF－2，编码自身的反式激活因子（transactivator of spumaviruses，Tas）。Tas不仅对自身LTR行使功能，而且能激活慢病毒的基因表达。近年来在泡沫病毒家族成员HFV^［2，3］、SFV-1型^［4］、SFV-3型^［5］中陆续发现了除5′LTR之外的第二类启动子。该启动子位于env基因内部，调节蛋白Tas编码区近上游，称为内部启动子（internal promoter，IP）。该启动子亦依赖于Tas。在牛泡沫病毒中是否存在内部启动子尚未见报道。

材料与方法

1病毒培养与细胞BFV₃₀₂₆毒株是本室从BIV检测为阳性的3026号牛外周血中分离得到的，经分子生物学鉴定，证明其为一株新的泡沫病毒^［6］。新生牛肺细胞（newborn bovine lung cells，NBL）用于BFV₃₀₂₆病毒株的繁殖。牛肺细胞系BL－12用于转染。

2病毒Hirt DNA的提取反转录病毒感染宿主细胞后首先反转录成双链DNA，在反转录病毒感染的细胞的细胞核内常常存在一些非整合的线形或环状双链DNA分子，通常称为Hirt DNA。按文献的方法从被BFV₃₀₂₆病毒株感染的NBL细胞中抽提NBL／BFV₃₀₂₆的Hirt DNA，并用TE缓冲液溶解。

3引物的设计与合成有关泡沫病毒内部启动子的序列尚无报道，本文根据BFV基因组序列，参与HFV、SFV－1的IP保守序列，化学合成1对引物P8564和P9488，旨在通过PCR扩增完整的BFV内部启动子。引物序列如下：

4PCR反应以NBL／BFV₃₀₂₆ Hirt DNA为模板进行PCR反应。反应条件为94℃4min，55℃1min，72℃3min，1个循环；94℃30s，55℃ 1min，72℃3min，35个循环；94℃30s，55℃1min，72℃10min，1个循环。扩增产物于1％琼脂糖凝胶电泳，观察照相。

5克隆与测序将BFV₃₀₂₆的PCR产物直接克隆到pGEM－T载体上（参见Promega产品说明书），并用SP6和T7引物对其进行序列分析。

6序列分析核苷酸的序列对比与分析采用Dnasis计算机分析软件（Hitachi Software Engineering Co. Ltd．）。

7功能质粒的构建以PCR方法扩增得到954bp内部启动子片段，将其正向连至载体pGEM－T上得到pT－BFVIP＋（8564／9517）（括号内数字为基因组编号）。经酶切鉴定正确之后，将其上的BFV IP片段亚克隆到质粒pBFVLTR-luc（本室保存）上替换BFV LTR 区段得到了报告质粒pBFVIP（8572／9509）-luc。该质粒的报告基因luciferase上游连有BFV完整的内部启动子。pRSV-BORF-1激活质粒由本室构建，即BFV反式激活因子Tas（ORF-1）基因连在RSV启动子下游。

8体外瞬时表达实验牛肺细胞系BL-12以3×10⁵ml^－1接种于6孔板，每孔2ml，于37℃ 5％CO₂条件下，10％胎牛血清DMEM培养基中培养。转染采用阳离子脂质体法（LipofectAMINE Reagent）。具体转染步骤参见GIBCO／BRL产品说明书。2天后裂解细胞测定Luc酶活力。细胞裂解液和Luc酶活力测定试剂盒购自Promega公司。按试剂盒提供的方法，用生物化学发光测量仪（上海检测技术所检测仪器厂生产）测定化学发光强度，方法原理见文献^［7］，Luc酶的活力以4S内的光强度表示。

结果

1完整的牛泡沫病毒内部启动子的克隆与序列分析

本文根据文献报道^［1］选择泡沫病毒中env基因3′端，相对保守的基因区段设计并合成BFV8564、BFV9488引物，以NBL／BFV₃₀₂₆ Hirt DNA为模板进行PCR，得到954 bp特异性带。而以NBL细胞DNA为模板或体系中不加任何DNA时则没有任何产物。回收954bp特异性PCR产物，直接与pGEM－T载体连接，转化E．coli JM103。使用IPTG，X－gal筛选白色转化子，得到质粒pT－BFVIP（8564／9517）。

采用SP6和T7引物，对克隆的8564～9517基因组区段进行序列分析，并将结果与已报道的BFV美国毒株基因组进行比较，发现在这954bp的片段中发生了7个碱基的改变。分别是8 583位G变成A，8 598位A变成G，8 722位A变成G，8 778位A变成G，9 061位C变成A，9 185位C变成T，9 361位G变成A，序列相似度达到99．3％。该片段中含有典型的真核启动子TATA盒（图1）。根据HFV、SFV－1中已有的报道，推测这段序列中含有完整的内部启动子（IP）。

2牛泡沫病毒内部启动子功能分析

2．1功能质粒构建为了测定IP的启动子活性，我们构建了IP的报告质粒。将质粒pT－BFVIP（8564／9517）用SalⅠ和HindⅢ酶切后，回收938bp小片段。同样用SalⅠ和HindⅢ切pBFVLTR－luc质粒，回收5．82kb大片段。将上述两个回收片段连接后转化E．coli TG1经酶切鉴定得到质粒pBFVIP（8572／9509）－luc。该片段在荧火虫荧光素酶报告基因上游连有牛泡沫病毒完整的内部启动子。该片段构建过程见图2。

图1克隆的牛泡沫病毒基因组8 564～9 517区段序列

Figure 1The sequence of BFV genome 8 564～9 517

图2pBFVIP（8572／9509）-luc报告质粒的构建过程

Figure 2Construction of the reported plasmid of pBFVIP（8572/9509）－luc

2．2功能分析为测定内部启动子的活性，将含完整内部启动子的报告质粒pBFVIP（8 572／9 509）-luc单独转染BL－12，测定IP的基础活性；将pBFVIP（8 572／9 509）-luc与含有BFV Tas基因的激活质粒pRSV-BORF-1共转染牛肺细胞系BL-12，测定IP被激活后的活性及激活倍数。转染结果如表1。

表1BFV LTR和IP的基础活性和激活活性比较