摘要：苜蓿尺蠖核型多角体病毒（Autographa californica nuclear polyhedrosis virus，AcMNPV）在细胞质中合成其囊膜蛋白，但在细胞核内组装并包埋病毒粒子，这些蛋白的核定向转运机制是人们甚感兴趣的课题。以AcMNPV多角体衍生型病毒ODV（occlusion－derived virus，ODV）的一种囊膜蛋白ODV－E18为对象，通过E18与一个标记短肽Flag融合的重组病毒的构建，以免疫荧光法跟踪检测E18蛋白的转运过程及形态，并利用酵母双杂交系统法（yeast two hybrid system），通过蛋白－蛋白相互作用的研究，寻找与E18紧密结合的可能的转运蛋白。研究结果表明，E18是先以核内模结构——微泡（microvesicle）的形式存在于核内的；一个被报道具有核定向转运功能的AcMNPV囊膜蛋白－ODV－E66能与E18形成紧密的复合体，推测E－66可能在E18的核定向转运中起着运载体的作用。

中图分类号：Q965.8文献标识码：A

文章编号：1000－8721（2000）03-0247-05

Studies on the Transporting and Targeting of Autographa Californica

Nuclear Polyhedrosis Virus ODV-E18

WU Jin-mei，LU Hong-sheng

（Sericultural Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Zhenjiang 212018, China）

WU Xiang-fu

（Institute of Biochemistry, Chinese Academy of Science, Shanghai 200031, China）

S. B. Braunagel，M D Summers

（Department of Entomology, Texas A&M University, College Station, TX77803）

Abstract: The envelope proteins of Autographa californica nuclear polyhedrosis virus (AcMNPV) occlusion-derived virus are synthesized in cytosolic plasma of their host cells, transported and assembled in the nuclei of the cells. The mechanism of protein transporting and targeting is of quite interest to us. In this study, a recombinant virus expressing the fusion protein of E18 and Flag marker peptide under AcMNPV polyhedrin promoter was constructed. Immunofluorescence was used to localize E18 in the recombinant virus infected cells and yeast two hybrid system was employed to find out the possible transporting protein which binds with E18. Our preliminary results showed that E18 existed first in the nuclei in the form of microvesicle-the intranuclear membrane structure and it might be transported into the nuclei through the interaction with another AcMNPV envelope protein-ODV-E66, the latter has been reported containing a 23-amino-acid sequence which is sufficient to direct reporter proteins to nucleus.

Key words: baculovirus; envelope protein; nuclear transporting and targeting; occlusion-derived virus; yeast two hybrid system; immunofluorescence

核糖体是细胞内进行蛋白质生物合成的部位。苜蓿尺蠖核型多角体病毒AcMNPV的多角体衍生型病毒ODV囊膜蛋白的合成位于胞质内质网上的核糖体，而囊膜蛋白包被病毒粒子并最终形成多角体却是在细胞核内进行。那么，这些囊膜蛋白是如何定向地从胞质转运至核内的呢？其实细胞并不是其蛋白质等组成成分的无序混合体，各种蛋白质需要在细胞特定的位置或微环境下才能发挥其功效^［1］，这已是科学家们的共识。然而对蛋白的定向转运及定位的机制目前了解较少。利用昆虫病毒来研究膜蛋白的定向转运及定位有其特殊的优点：由于病毒的基因组较小，研究起来相对容易；随着病毒的繁殖，所表达的蛋白的量也随之增多，易于跟踪研究；昆虫细胞也属于真核细胞，它与哺乳动物细胞又有许多相似之处，因此研究昆虫病毒的核定向转运途径及机制，无疑将有助于阐明哺乳动物细胞膜蛋白转运的相关问题^［2］。

AcMNPV在其感染过程中可产生两种子代病毒：芽生病毒（budded virus，BV）及多角体衍生病毒ODV。BV是当核衣壳从细胞表面出芽时从细胞质膜获得其囊膜；而ODV是在所感染的细胞核的核质内获得囊膜，之后被包埋进多角体蛋白的结晶基质而形成多角体。当感染细胞解体时，多角体释放于环境中，一旦为别的昆虫食下，即可引起原发感染^［3］。AcMNPV ODV－E18是ODV特异的囊膜蛋白之一（E代表囊膜，envelope的英文首字母，18代表蛋白的分子量kD），其转录、翻译及细胞定位已有报道^［4］。本文以ODV－E18为研究对象，通过构建ODV－E18与标记短肽Flag融合表达的高表达重组病毒，分析重组病毒感染宿主细胞时该囊膜蛋白在胞质及核内的表达时相，以及利用细胞免疫荧光组化法观察其转运的过程及形态，最后用酵母双杂交系统法寻找与其紧密结合的可能的转运蛋白，对其核转运机制进行初步探讨。

材料与方法

1材料质粒pVL－1393和含完整E18基因的质粒pUC－E43NF、大肠杆菌菌株DH5α、AcMNPV病毒E2株、秋粘虫细胞株Sf9等， 由美国Texas A＆M University的M.D.Summers教授实验室保存并提供。昆虫细胞培养基为TNM－FH。DNA测序试剂盒为美国USB公司的产品（Version 2.0）。鼠抗Flag的M2抗体为IBI公司产品；FITC偶联的抗鼠IgG的二次抗体（anti－mouse－IgG－FITC）为Sigma公司产品。Western转移用膜为PVDF膜（Immobilon－P，Millipore公司产品）。蛋白分子量标准为BioRad公司的产品。AcMNPV感染的Sf9细胞的cDNA文库由Dr.M.D.Summers教授实验室完成并保存。酵母双杂交系统试剂盒购自Clontech公司。

2含标记短肽Flag与ODV－E18融合表达的重组病毒rvPh－E18F的构建

2.1pVL1393－E18F转移载体的构建其构建策略如图1所示。简要步骤如下：我们以BamHI和XbaI消化pUC－E43NF质粒DNA和pVL1393 DNA，经低熔点琼脂糖凝胶电泳及纯化，各得大小约为500bp和9kb大小的含E－18F和pVL1393的片段。此两片段以T4DNA连接酶在16℃连接过夜，并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，碱裂解法快速抽提菌落DNA；经酶切验证和DNA测序分析，证明E18F已正确地插入到pVL1393的多角体蛋白的启动子下（图1）。具体的实验操作方法参见Maniatis等的分子克隆操作手册^［5］。

图1pVL1393－E18F转移载体的构建图

Figure 1Construction of the transfer vector pVL1393－E18F

2.2测序及DNA序列分析主要参照美国USB的DNA测序试剂盒（2.0版本）中的操作手册进行。

2.3共转染、空斑纯化及重组病毒感染母液的制备将pVL1393－E18F转移载体与Bsu36I消化的BacPAK6DNA以磷酸钙法^［6］共转染秋粘虫Sf9细胞；经两轮空斑纯化，将挑取的空斑置于1ml TNM－FH培养基中，室温震摇过夜，使病毒充分释放至培养基中。将此液感染培养于6孔板的Sf9细胞，收集感染良好的细胞上清，一部分用于病毒的进一步扩增感染，其它分置于冷冻管中于－80℃保存，此液作为rvPh－E18F重组病毒的感染母液P1。取此P1液400μl继续感染T25细胞培养瓶中的细胞，收集感染4～5天后的感染液作为母液P2保存。制备P3感染液的方法为：先利用终点稀释法^［6］测定P2母液的病毒滴度，后以0.5的感染复数（MOI）感染培养于200ml转瓶内的细胞，27℃悬浮培养约4天，待其充分感染后收集上清，测定滴度，于4℃作为P3保存。

3胞质、核质的制备及Western blotting分析胞质、核质的制备主要参见文献^［7］，略有修改。主要步骤为：收集在T25培养瓶内感染的细胞，以冷的PBS洗后3 000r／min离心 5min，加300μlTBN（10mmol／L Tris pH6.5，140mmol／L NaCl，3mmol／L MgCl₂，0.5％NP40）以及每毫升500个单位的蛋白酶抑制剂aprotinin，冰上置30min后离心，上清移至新管；将沉淀悬浮于50μlRIPA（50mmol／L Tris pH8.0，100mmol／L NaCl，3mmol／L MgCl₂，1％NP－40，每毫升500个单位的蛋白酶抑制剂aprotinin）液中，用注射针筒将此液上下抽吸多次以使DNA断裂，离心，上清贮存于－20℃。

Western blot按常规方法^［5］进行，略有修改。SDS－PAGE所用分离胶浓度为12.5％，浓缩胶5％。样品上样前先用Bradford法测定样品蛋白浓度^［8］，每孔所加蛋白量为15μg。所用的一抗为鼠抗Flag的M2抗体，二抗为辣根过氧化物酶偶联的羊抗鼠IgG。显色方法参照Amersham Life Science的ECL Western Blotting操作手册进行。

4细胞免疫荧光分析以20MOI rvPh－E18F的重组病毒感染6孔培养板中每孔细胞初始密度为1×10⁶的Sf9细胞。在感染后各设定的不同时间点上收集感染细胞，转移至无菌的离心管中。1 000r／min离心5min，将细胞悬浮于Grace培养基中，1 500r／min离心5min，去上清，细胞重新悬浮于1ml Grace培养液中。以血球计数器计算细胞密度后加入大约1.7×10⁵个细胞于细胞离心器（cytofuge）的玻片上<