设为首页
加入收藏
求医中医药网
www.qe.cn
站内搜索
IBDV基因组dsRNA从用鸡胚成纤维细胞培养的病毒颗粒中提取。根据已报道的加拿大OH毒株的B片段序列设计三对引物。
第一对引物为：5′CCTCTTCTTGATGATTCTGCCACC 3′
5′ACTAAAGCCCGCATGATAAGTACC3′
第二对引物为：5′GGGTCAAACAAGAAGAAGCTACTC3′
5′AGTTGGGCTGGATTGTTGTTGTTC′
第三对引物为：5′CTTGCACAACCAGGGTACCTGAGT3′
5′GCTATTGGCGGCTCTCTTTTTGGC3′
用DMSO对dsRNA进行反转录前变性处理后，用常规方法进行RT－PCR，从而获得976bp、774bp、997bp的3段部分重叠且重叠部分包括特异酶切位点（sphI和kpnI位点）的扩增产物。这样便于以后把3个片段连接为一个完整的阅读框，对VP1的功能进行进一步的研究。扩增片段分别克隆于pGEM－Teasy载体，转化感受态细胞E.coli DH5α，提取质粒进行酶切鉴定，阳性克隆进行测序反应，在PE公司ABI－377型全自动测序仪上测定核苷酸序列。测定结果与GenBank中“IL4”、“2512”、“Variant E”、“UK661”、“OKYM”、“OH”、“HK46”7种毒株的B片段核苷酸序列及氨基酸序列进行比较(“OH”毒株为血清Ⅱ型）。Ts株与7种IBDV毒株B片段核苷酸序列同源性介于87％～99％；氨系酸序列同源性介于91.01％～96.35％。血清Ⅱ型“OH”株的氨基酸序列从100～135位发生移码突变，这可能导致了血清型的改变。由于Ts毒株B片段核苷酸序列中复杂的二级结构及高级结构的影响，热变性法不能彻底使dsRNA变性，而使用DMSO后反转录才能顺利进行。另外，血清I型Ts强毒株与疫苗弱毒株“2512”无论在核苷酸序列还是在氨基酸序列上均表现最高同源性，血清Ⅱ型“OH”株与血清I型Ts株氨基酸序列同源性仅为91％，且出现36个氨基酸的移码突变，这似乎表明：B片段并非影响IBDV毒力的高低，而是决定了毒力的有无。
