摘要：选择乙型肝炎（乙肝）病毒核心抗原（HBcAg）、e抗原（HBeAg）及单纯疱疹病毒gD抗原（HSV－1－gD）基因为目的基因，进行DNA疫苗联合免疫的研究。通过对不同基因片段的表达研究，选择了能在哺乳动物细胞中高效表达乙肝病毒核心抗原、e抗原和单纯疱疹病毒gD抗原的质粒DNA免疫Balb／c小鼠。结果显示：表达乙肝病毒核心抗原和单纯疱疹病毒gD抗原的DNA疫苗单独免疫，能有效刺激机体产生体液免疫和细胞免疫，二者的联合免疫明显加强了这种免疫效果，并可以使乙肝核心抗体提前出现。但表达乙肝病毒e抗原和单纯疱疹病毒gD抗原的DNA疫苗联合免疫则加强作用不明显。这些结果表明：不同DNA疫苗的适当组合有可能在获得多价疫苗的同时，提高DNA疫苗的免疫效果。

中图分类号：Q789，R373.2^＋1文献标识码：A

文章编号：1000－8721（2000）03-0212-07

Immune Response Can Be Enhanced by Inoculation of Combined(Different)DNA Vaccines

MENG Xin，RUAN Li，WEI Bo，LIU Wen-jun，ZHU Ji-ming（Institute of Virology, Chinese Academy of Preventive Medicine, Beijing 100052, China）

Abstract: In this experiment, a series of plasmids which harboring the HBcAg, HBeAg and HSV-1-gD genes respectively have been constructed as DNA vaccines. Some of them could highly express their target genes in tissue cultures. The single inoculation of the plasmids expressing HBcAg, and HSV-1-gD showed inducement of both humoral and cellular immune responses efficiently. The combined DNA immunization with these two plasmids could not only enhance the immune response obviously, but also the early appearance of HBcAb. The combined immunization of plasmids expressing HBeAg and HSV-1 gD showed no obvious enhancement of immune response. Our work offers a new approach to improve the immune response by multivalent DNA vaccine, if the vaccine DNAs are properly combined.

Key words: DNA vaccine; immune enhancement; multivalent vaccine; HBcAg; HBeAg; HSV-1-gD

DNA疫苗是近十年以来随着分子生物学、分子免疫学等学科的发展而出现的一种新型疫苗，它与常规疫苗相比有诸多优点：可以激发全面和持久的细胞免疫和体液免疫，易于构建和改造，易于构成多价疫苗，成本低廉，热稳定性好等等^［1］；在预防某些多型善变的病原体如流感、HIV感染方面表现尤为突出。迄今为止，已有大量报道DNA疫苗被用于艾滋病、流感、肝炎病毒、巨细胞病毒感染等病毒性疾病，结核等细菌性疾病，疟疾等寄生虫病的防治研究，以及抗肿瘤、抗自身免疫病的实验性治疗中。其中一些DNA疫苗已经美国FDA批准进行了小量人体试验^［2］。

DNA疫苗尽管有诸多优点，但也有明显不足，其安全性目前尚无定论，质粒导入细胞效率低，诱发的免疫效果也相对较弱，等等。因此，各种增强DNA疫苗免疫效果的方法一直在研究和改进中。如在质粒构建时导入非甲基化的CpG序列，以使某些细胞因子的活性增强；与某些表达细胞因子如GM－CSF、IL－12等真核表达质粒共同免疫，也被证明有很好的加强免疫的作用。从理论上讲，表达不同抗原的DNA疫苗联合免疫除了可能起到多价疫苗的作用之外，还有可能在体液免疫和细胞免疫水平上产生相互影响，出现免疫增强或免疫抑制的情况。因此对这类问题的研究将不但有利于提高DNA疫苗的免疫效果，而且将为DNA多价疫苗的研究提供有意义的资料。

乙型肝炎（乙肝）病毒核心抗原和单纯疱疹病毒gD糖蛋白都是相应病原体引起细胞免疫和体液免疫的主要抗原，在疾病的预防和转归中具有重要意义。因此本文选择上述两种抗原基因，构建可在真核细胞中表达的DNA疫苗，分别单独和联合免疫Balb／c小鼠，对其诱导的免疫反应的特点、效果及相互影响进行了研究。

材料与方法

1质粒、病毒与细胞株、菌株pHBV-2质粒由本实验室提供，含有全长的HBV（ayw亚型）序列。pSK／HSV-1-gD质粒由病毒基因工程国家重点实验室提供，含有1.2kb HSV-1 gD糖蛋白基因。pcDNAI、pCMVβ均为商品化真核细胞表达质粒。pcDNAI-β质粒由本室构建，表达β-半乳糖苷酶。表达HSV-1 gD糖蛋白的重组痘苗病毒vRHSV1175D由病毒基因工程国家重点实验室提供。HSV-1病毒标准株由本所毒种室提供。293细胞购于美国ATCC，P₈₁₅细胞由本所肿瘤病毒研究室和毒种室提供。

2酶和试剂及免疫检测试剂实验用酶类购于美国New England Biolabs公司、Promega公司、华美生物技术公司。脂质体转化试剂盒购于美国GIBCO公司。Na₂⁵¹CrO₄购于美国杜邦公司。乙肝病毒核心抗原特异性CTL表位短肽SYMNTNMGL^［3］由赛百盛公司合成。其余试剂均为常规分析纯试剂。乙肝病毒核心抗原及e抗原由军事医学科学院凌世淦教授惠赠。乙肝核心抗体A3H6、乙肝e抗体C4B8及共同抗体1G8由本所肝炎室詹美云教授惠赠。HSV-1gD糖蛋白纯品、兔抗gD血清RT及抗gD单克隆抗体ID3均由美国Philadelphia大学Dr.Willis惠赠。

3质粒的构建、鉴定、提取和纯化按文献进行^［4］。

4质粒的体外短暂表达取已经纯化的等摩尔数的质粒，加入等量的表达β-半乳糖苷酶的质粒作为内对照，脂质体法转染70％～80％成片的293细胞。48h～72h后，取上清放入透析袋中，10倍风干浓缩，检测HBeAg。同时刮下细胞，重悬于0.5ml PBS中，超声破碎细胞，提取细胞内容物作HBcAg检测和β－半乳糖苷酶测定^［5］。

5ELISA检测抗原抗体采用夹心法检测HBcAg和HBeAg，乙肝核心抗体（HBcAb）和乙肝e抗体（HBeAb），HSV－1gD糖蛋白。包被抗体用包被液1∶1?000稀释，20％小牛血清封闭1h后加待检样品，37℃1h。洗板3遍后，加入第二抗体或酶标第二抗体，37℃1h。而加入酶标二抗的则直接检测；加入第2抗体的在洗板3遍后，加入HRP标记的羊抗鼠IgG，37℃1h；加入OPD显色液100μl／孔，室温10min，50μl2mol／L硫酸终止反应。490nm测OD值。

6免疫小鼠将Balb／c小鼠随机分组，每组6只。注射质粒前24h乙醚麻醉小鼠，每只小鼠均在左胫骨前肌部位用4号针头肌肉注射25％蔗糖溶液100μl，分3点注射。24h后，每只小鼠在上次注射相同部位按同样方法注射100μl质粒液（包括两种质粒同时注射），两周后加强免疫1次。每只小鼠在免疫后不同时间用眼底取血法采集血清，检测抗体水平。

7CTL的检测^［6］

刺激细胞制备：常规制备小鼠脾细胞悬液，未免疫鼠脾细胞加入配好的ConA和乙肝病毒核心抗原特异性CTL表位九肽SYMNTNMGL，终浓度分别为2μg／ml和50μg／ml。在37℃ 5％CO₂孵箱中孵育4h后，加入丝裂霉素C，终浓度80μg／ml。在37℃ 5％CO₂孵箱中继续孵育2h。无血清RPMI 1640洗3次，然后调细胞浓度为2.5×10⁶／ml作为刺激细胞。

效应细胞制备：每只免疫鼠脾细胞经无血清RPMI 1640洗后计数，用含10％小牛血清的完全培养基调细胞数为1×10⁷／ml。取1ml加入24孔细胞培养板，每孔再加入1ml刺激细胞。培养液中加入rIL-2，终浓度为20μ／ml，然后放入37℃ 5％ CO₂孵箱中共培养4～6天。调节反应细胞数为1×10⁷／ml。按3个梯度接种于96孔板，每个梯度接种3孔。

靶细胞制备及杀伤实验：每1×10⁶P₈₁₅细胞（H－2^d）用100μl含2mg／ml九肽SYMNTNMGL的完全培养基重悬该细胞。加入100μl Na₂⁵¹CrO₄，在37℃ 5％ CO₂条件下共培养1.5h。无血清RPMI 1640培养基洗3次，调节细胞浓度为1×10⁵／ml。按100μl／孔加入预先已接种反应细胞的96孔板，形成不同的效∶靶比（E∶T）。同时做自然释放和最大释放对照，在37℃ 5％ CO₂条件下共培养6h。水平离心机1?500r／min离心96孔板5min，小心吸取100μl上清，γ-计数仪读取cpm值。按公式计算杀伤率：

HSV-1gD抗原的CTL检测方法与HBV核心抗原的检测方法基本相同，但在制备刺激细胞时采用10MOI的重组痘苗病毒VRHB1175D（表达HSV-1 gD糖蛋白的重组痘苗病毒疫苗）感染过夜，同样加入丝裂霉素C后孵育2h，无血清RPMI 1640洗3次后，调细胞浓度为2.5×10⁶／ml。靶细胞的处理是用10MOI HSV-1病毒感染P₈₁₅细胞过夜，无血清RPMI1640洗3次后加入100μlNa₂⁵¹CrO₄标记，37℃ 5％CO₂条件下培养1.5h，再用无血清RPMI 1640洗3次后，调节细胞浓度为1×10⁵／ml，其余各步骤及杀伤率的计算与检测乙肝病毒核心抗原的方法完全一致。

结果

1目的基因的选择与重组质粒构建

考虑到乙肝病毒核心抗原与e抗原分别为非