摘要：为了探讨EB病毒潜伏膜蛋白1（LMP1）的致瘤机制，对鼻咽癌细胞中LMP1通过核转录因子κB（NFκB）介导的信号传导途径在鼻咽癌变中的意义进行了研究。利用LMP1受四环素衍生物强力霉素诱导表达的鼻咽癌细胞Tet-on-LMP1 HNE2，通过NFκB报道基因分析法、凝胶迁移率分析（EMSA）及细胞集落形成率等方法，结合硫代磷酸反义寡核苷酸阻断技术，证实LMP1增强鼻咽癌细胞NFκB的DNA结合活性和反式激活活性，这种增强的活性可被LMP1及NFκB p65硫代磷酸反义寡核苷酸阻断，而NFκB p50仅阻断DNA结合活性，对反式激活活性无影响。同时，LMP1及NFκB p65硫代磷酸反义寡核苷酸可部分逆转鼻咽癌细胞的恶性表型，而反义p50这种效应不显著。这些结果表明，LMP1在鼻咽癌中通过NFκB信号传导途径可能参与了鼻咽癌变，NFκB p65可能是主要的效应者。

中图分类号：R373 文献标识码：A

文章编号：1000－8721（2000）03-0198-05

The Epstein-Barr Virus Encoded Latent Membrane Protein 1 Promotes Nuclear Factor-kappa B Activity in a Nasopharyngeal Carcinoma Cell Line

LIAO Wei，TANG Min，DENG Xi-yun，CAO Ya（Cancer Research Institute, Hunan Medical University, Changsha, Hunan 410078, China）

Abstract: As an oncogenic protein, the Epstein-Barr virus encoded latent membrane protein 1(LMP1)may play a key role in nasopharyngeal carcinogenesis through its signal transduction pathway, especially NF-κB pathway. In order to attest this hypothesis, a dual-stable LMP1 integrated nasopharyngeal carcinoma cell line with Tet-on regulating system designated Tet-on-LMP1 HNE2, in which expression of LMP1 could be dose-dependent regulated by doxycycline, was used. It was found that NFκB activity was 3-10 folds high at LMP1 induced statement by reporter gene analysis, and this result was further confirmed by electrophoresis mobility shift assay which showed NFκB accumulated in nuclear when LMP1 expression was induced. When Tet-on-LMP1 HNE2 cells were co-incubated with phosphorothioate oligonucleotides (PS-ODNs) to antisense LMP1, NFκB p65 and NFκB p50 at various times, NFκB activity curves showed that antisense LMP1 blocked NFκB activity at earlier time than antisense p65 did, and p50 showed no block effect. What's more, PS-ODNs to antisense LMP1 and NFκB p65, but not p50, partially reversed malignant phenotype of Tet-on-LMP1 HNE2 boosted by LMP1 expression. All of these deduced that LMP1 could participate in the nasopharyngeal carcinogenesis by improving NFκB activity in NPC, and NFκB, of which p65 in particular, has the potency used as a molecular target to NPC gene therapy.

Key words: Epstein-Barr virus latent membrane protein 1; nuclear factor-kappa B(NFκB); nasopharyngeal carcinoma

核转录因子κB（NFκB）是近年来研究的热点，因与免疫球蛋白kappa轻链基因（Igκ基因）的3′末端增强子结合而得名^［1］。NFκB属于一个高度保守的反式激活因子家族，由多个成员组成，包括Dif、Dorsal、Relish、v-rel、c-rel、p50（NF-κB1）、p65（RelA）、RelB和p52。家族中每个成员都包含N末端由300个氨基酸组成的保守序列，称rel同源区域（rel homology domain，RHD）。该区域负责DNA-binding、二聚体聚合及同IκB家族结合等功能，其中Dif、Dorsal、Relish、v-rel、c-rel、p65（RelA）和RelB C末端具有与反式激活相关的部位（transactivation site），p52与p50则没有。NFκB家族成员之间可形成同源二聚体如p50∶p50，或异源二聚体如p50∶p65等。在大多数细胞类型中，NFκB表现为p50∶p65二聚体形式，其他类型的二聚体同时也有低水平的表达^［2］。

位于胞浆内的NFκB一般与NFκB活性抑制因子IκBα结合，其Rel同源区域被遮蔽，从而不能进入核内发挥反式激活活性。在外来刺激因素，如UV紫外线、氧自由基、病毒和细菌内毒素等的作用下，IκBα被磷酸化并降解，NFκB与IκBα解离，由胞浆转位入细胞核，启动具有κB结合位点的基因转录表达。作为重要的转录调控因子，NFκB调节很多的基因表达，这些基因与细胞增殖、分化、免疫反应、凋亡、转化有着密切关系^［3］。

EB病毒是已被认为与鼻咽癌发病密切相关的因素，其编码的潜伏膜蛋白LMP1由于具有潜在的致瘤作用，而成为近年来EB病毒致瘤机制研究的热点。研究发现，LMP1可能类似于肿瘤坏死因子家族成员CD40，在细胞增殖及凋亡的信号传导途径中具有重要的作用。在LMP1所介导的细胞调控网络系统中，NFκB处于信号传导枢纽。近年来研究发现，LMP1蛋白至少可以通过两条途径磷酸化IκBα并活化NFκB：一条为肿瘤坏死因子相关蛋白（tumor necrosis factor receptor associated factors，TRAFs）途径^［4］；另一条为肿瘤坏死因子受体死亡结构域（tumor necrosis factor receptor associated death domain protein，TRADD）途径^［5］。其中TRAFs与CTAR1结合，激活大约25％的NFκB活性；TRADD与CTAR2结合，75％的NFκB的活化与此相关。当LMP1的6个跨膜结构域聚合后，TRAFs和TRADD与LMP1上各自的结构域结合，激活Iκ激酶，Iκ激酶活化后，促使IκBα磷酸化，活化NFκB。

作为与鼻咽癌发病密切相关的EB病毒瘤基因，LMP1能通过磷酸化IκBα而活化NFκB，从而提示我们探讨在鼻咽癌中LMP1能否调节NFκB的活性及LMP1是否通过NFκB信号传导途径参与鼻咽癌变的过程等问题，对于阐述EB病毒致鼻咽癌的可能机理并提出鼻咽癌“靶分子”治疗新策略具有较为重要的意义。

材料与方法

1细胞系鼻咽癌细胞系HNE2是湖南医科大学肿瘤研究所建立的EB病毒阴性的低分化鳞癌细胞株^［6］。PCR进一步证实其中LMP1为阴性。经两轮稳定的转染，将四环素基因调控系统导入其中，构建LMP1受四环素衍生物强力霉素诱导表达的鼻咽癌细胞系pTet-on-LMP1 HNE2^［7］。细胞培养液为含15％小牛血清的RPMI-1640。37℃ 5％CO₂维持200mg／L G418和50mg／L潮霉素以筛选药物浓度。

2硫代磷酸化寡脱氧核苷酸有义和反义NFκB p65及p50的设计硫代磷酸化修饰的寡脱氧核苷酸是进行反义核酸干预的有效方法。根据文献^［8］，设计针对p65及p50的3′末端硫代磷酸化修饰的有义和反义寡脱氧核苷酸，NFκB p65有义寡脱氧核苷酸：5′-CGGCCATGGACGAACTGTTC-3′，反义寡脱氧核苷酸：5′-GAACAGTTCGTCCACATGGCCCA-CTTC-3＇；NFκBp50有义寡脱氧核苷酸；5＇-ATCTTCACCATGGCAGCAGA-3＇，反义寡脱氧核苷酸：5＇-ATCGTCTGCCATGGTGAAGAT-3＇。以上寡脱氧核苷酸由美国国立癌症研究院DNA重组实验室合成，使用浓度为20mg／L浓度。

3NFκB报道基因分析用NFκB报道基因质粒pNFκB－luc的荧光素酶表达分析NFκB的活性。pNFκB－luc包含螟蛾科荧光素酶基因，它的表达受CMV启动子调控，在CMV启动子中插入了来源于HIV LTR的κB元件。用LipofecTAMINE的方法将pNFκB－luc一过性转染入细胞，转染12～48h后，按荧光素酶分析系统的说明，加入100μl 1×裂解缓冲液，室温下裂解15min，用细胞刮子将细胞刮下，吸至离心管内，12?000r／min离心，取20μl上清液，加入100μl反应底物（Luciferaly－CoA），迅速推入液闪仪（BECKMAN LS5000 TA）单光子档，检测cpm值。间隔10s，每一个样本读两个数值，取均值。

4凝胶迁移率分析（electrophoresis mobility shift assay，EMSA）细胞核蛋白的提取参照Ichikawa^［9］等的方法进行，收集细胞，冷PBS洗1次，约10⁷个细胞用1ml SMTD－PMSF（0.25mol／L蔗糖，1mmol／L MgCl₂，20mmol／L Tris－HCl pH7.85，1mmol／L DTT，0.1mmol／LPMSF）重悬细胞，玻璃匀浆器匀浆4次，加入Triton X－100至终浓度1％，再匀浆2次，离心（1?000g×10min），弃上清，1ml含0.5％Triton X－100的SMTD－PMSF重悬沉淀，玻璃匀浆器再匀浆2次，离心，沉淀再用1ml含1mmol／L CaCl₂的SMTD－PMSF洗1次，离心，用与细胞核等体积的KMTD（0.3％KCl，1mmol／L，MgCl₂，10mmol／L Tris－HCl pH8.0，1mmol／L DTT）室温温育1h，每隔15min剧烈振动1次，15?000g×15min离心，保留上清核提取物。蛋白浓度用BCA检测试剂（Pierce Chemical Co，Rockford，IL）测定。EMSA分析按照Promega公司Gel shift assay kit操作手册的说明进行。首先用γ－³²P－ATP在T4多核苷酸激酶的作用下，连接至NFκB寡核苷酸，37℃ 20min EDTA终止反应，加入89μl TE缓冲液，用G－25柱层析方法纯化探针。约5μg核蛋白与Kit中的结合缓冲液（binding buffer）作用10min，同时以Kit中提供的HeLa细胞核蛋白10μg作为阳性对照；加入1μl纯化后的³²P标记NFκB consensus oligo，室温放置约3h，加入1μl加样缓冲液，于4％聚丙烯酰胺凝胶（acrylamide∶bis为39∶1）进行电泳分离。待加样缓冲液中的染料溴酚蓝距电泳槽底部1／4距离时，终止电泳。用带有增感屏的暗闸进行X光片显影、曝光。