摘要：克隆并测定了引起产科新生儿腹泻暴发的P2[6]、G4型轮状病毒(BN株)VP4的VP8片段和VP7编码基因的核苷酸序列，并据此推导出其氨基酸序列。与相应标准株和地方株(包括有毒株和无毒株)比较的结果表明，所测VP8序列与相同型别(P2[6])的标准株M37(无毒株)和ST3(无毒株)、地方株N16(无毒株)和VE7156(有毒株)之间的同源性为92.8％～98.6％，胰酶作用位点各毒株间相同；位于aa49、aa50、aa52、aa53、aa78处的氨基酸在有毒株与无毒株间(包括BN株)不同，但分别保守。VP7基因与同型(G4)标准株ST3(A亚型/无毒株)和VA70(B亚型/有毒株)、意大利地方株PV5249(A亚型/有毒株)和北京地方株CR117(有毒株)、同型猪有毒株Gott之间的同源性为91.4％～97.8％，其中与A亚型的同源性为95.5％～96.3％，而与B亚型的同源性为91.4％，提示VP7为G4A亚型，位于aa38、aa78、aa145、aa238位点的氨基酸在有毒株与无毒株之间不同，但分别保守。分析了虽为P2[6]型却反常地引起新生儿腹泻暴发毒株(BN)的VP8与VP7基因的变异情况，并对轮状病毒毒力与VP4、VP7基因变异的相互关系进行了讨论，为慎重确定轮状病毒疫苗候选毒株提供理论依据。

中图分类号：R373.9；Q78文献标识码：A文章编号：1000-8721(1999)04-0314-09

A PRELIMINARY STUDY ON RELATIONSHIP BETWEEN THE VIRAL VIRULENCE AND VIRAL GENES ENCODING VP4 VP7 PROTEINS OF P2 [6] G4 ROTAVIRUSE THAT CAUSED A NEONATAL DIARRHEA OUTBREAK

XIAO Wei, QIAN Yuan, ZHANG You

(Beijing Municipal Laboratory of Infection and Immunity, Beijing Gene Diagnosis Center of Capital Institute of Pediatrics, Beijing 100020, China)

Abstract: The genes encoding VP8 (specific fragment from VP4 gene) and VP7 of BN rotavirus strain (serotype and genotype P2 [6] G4), which caused a neonatal diarrhea outbreak in Beijing, were cloned and sequenced, and their deduced amino acid sequences were analyzed. Amino acid homology of VP8 of BN strain (P2 [6] ) to corresponding type P2 [6] reference strains M37 (asymptomatic)、ST3 (asymptomatic) and field strains N16 (asymptomatic)、VE7156(symptomatic) ranged from 92.8-98.6%, all of these P2 [6] rotavirus strains (asymptomatic and symptomatic) had identical sequences in the trypsin cleavage sites. Amino acid homology of VP7 (G4) to corresponding serotype G4 reference strains ST3 (G4A/asymptomatic)、VA70 (G4B/symptomatic) and field strains PV5249 (G4A/symptomatic)、CR117 (symptomatic) and Gottfried strain of Porcine (G4/symptomatic) ranged from 91.4-97.8%, in which the homology to G4 A subtype rotaviruses (95.5-96.3%) was higher than that to G4 B subtype rotaviruses (91.4%), suggesting VP7 of BN strain belongs to A subtype for G4 serotype. The P2 [6] rotavirus used to be believed to associate with asymptomatic infections, but BN strain rotavirus belonging to P2 [6] type caused an diarrhea outbreak in neonates. The variation of the genes encoding VP8、VP7 and the correlation between variation and viral virulence were discussed.

Key words: Rotavirus; Virulence; Genotype; Serotype; VP4; VP7

A组轮状病毒是婴幼儿重症腹泻的最重要病原，其两个主要外壳结构蛋白VP4与VP7分别形成独立的分型系统P血清型和G血清型。VP4为蛋白酶(proteinase)敏感蛋白，因此称为P血清型，同时，VP4又依基因序列不同而分型，称为P[]基因型。而VP7为糖蛋白(glycoprotein)，因此称为G血清型。迄今，已知有13个P血清型、20个P[]基因型和14个G血清型。其中属P2血清型的毒株又为P[6]基因型，通常从无症状感染的新生儿的粪便中分离^[1]，一般认为是自然减毒株或无毒株，其VP7既可以是G1，也可以是G2、G3或G4，代表株为M37。同时，VP4和VP7还分别诱导产生中和抗体，从而成为疫苗研制的重要成分^[2]，因此有人建议将P2[6]型无毒株作为自然减毒的最佳的多价疫苗候选毒株^[2，3]。

然而，最近我们发现一起轮状病毒(BN株)引起的北京一医院产科母婴同室新生儿腹泻暴发，经斑点杂交及巢式PCR证实，其VP4和VP7为P2G4型^[4]，并初步判定其VP4为P[6]基因型。这显然与上述相饽。Hoshino和Kirkwood报道，VP4、VP7各自独立地在轮状病毒的毒力方面起着重要作用^[5，6]。VP4在胰酶作用下可裂解为VP8和VP5两个片段，其中VP8含有与毒力有关的胰酶作用区^[7]，并且抗原分析确定，VP8片段包含了VP4主要抗原位点，且负责VP4血清型特异中和反应^[8，9]。为了解通常认为无毒而此次引起新生儿腹泻暴发的P2型毒株(BN)的主要结构蛋白VP4和VP7的基因，更进一步地认识轮状病毒的毒力相关基因，以期对我国轮状病毒的流行和毒力变异作深入的了解，为轮状病毒感染的防治提供帮助，我们克隆并测定了此有毒新生儿株(BN株)的VP8和VP7编码基因，并推导出氨基酸序列，分别与已发表的有毒的和无毒的相同型别的标准株、地方株序列进行比较。

材料与方法

1病毒BN毒株是1997年11月在北京某医院产科母婴同室的新生儿腹泻暴发患者的粪便中经用10％聚丙烯酰胺凝胶电泳检测到的，所有检测的标本均呈现完全一致的A组轮状病毒核酸图形；而同期采集的无腹泻症状新生儿的粪便标本中未检测到轮状病毒核酸；同期收集的门诊腹泻患儿粪便中的轮状病毒核酸图型与新生儿标本中的不一致，呈现多样的核酸图形。进一步用斑点杂交和巢式PCR鉴定证明，所有检测到的BN株均是：VP4为P2型，VP7为G4型。而门诊病人标本中的轮状病毒其VP4均为P1型，VP7为1型或2型^[4]。用于比较的P2[6]型毒株有从无症状新生儿粪便中分离到的无毒株：标准株M37、ST3，北京地方株N16^[10]；引起新生儿腹泻的有毒株：美国地方株VE7156^[11]。G4型毒株：标准株ST3(4A亚型/无毒株)^[12]、VA70(4B亚型/有毒株)^[12]，北京地方株CR117(有毒株)^[13]，意大利地方株PV5249(4A亚型/有毒株)^[12]，引起猪腹泻的有毒株Gottfried(Gott)^[12]。

2病毒RNA的提取400μl 10％粪便经1%SDS 56℃作用30分钟，加等体积的酚-氯仿抽提后用羟基磷灰石(HA)纯化病毒dsRNA^[10]。

3逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)模板为上述纯化的病毒dsRNA。参照Gentsoh^[14]设计引物P1(con3)(nt1-17)：5′-GGCTATAAAATGGCTTC-3′，P2(con2)(nt887-868)：5′-ATTTCGGACCATTTATAACC-3′用于扩增VP8片段；P3(END9)(-)：5′-GGTCACATCATACAATTCTAATCTAAG-3′(1 062～1 036)和P4(BEG9)(＋)：5′-GGCTTTAAAAGAGAGAATTTCCGTCTGG-3′(1～28)用于扩增VP7全基因^[13]。RT-PCR参照文献^[15]进行。

4克隆用Millipore柱纯化PCR产物，末端用T4DNA多聚酶补齐后插入质粒pTZ18R的Smal I处，具体方法见文献^[10]。

5测序用T7 DNA测序试剂盒，按说明书用末端终止法分别对VP4和VP7两个基因的两个阳性克隆同时进行测序。所用引物为pTZ18R上的-40、Reverse及根据VP4基因上的相对保守区设计的引物P5(nt206～223)：5′-GATGGTCCTTATCAAC-3′、P6(nt658～639)：5′-CATTACACTTAGATTCTTG-3′和根据VP7基因设计的引物P7(nt552～531)：5′-CCATTGGATTACACAACCATTC-3′、P8(nt819～801)：5′-GCTACGTTTTCTCTTGGTCC-3′。用DNASIS和PROSIS软件进行核苷酸及氨基酸序列分析。

6主要工具酶和试剂实验用各种限制性内切酶、Taq DNA聚合酶、T4DNA多聚酶、T4DNA连接酶、CIP等均购自GIBCO BRL公司。引物由上海生工生物工程有限公司合成。T7DNA测序试剂盒购于上海 Promega公司。[α-³²P]dATP购自福瑞公司。

结果

按T7 DNA测序试剂盒说明，用末端终止法分别对上述阳性克隆的双链cDNA测序。同时推导出氨基酸序列，分别与相应的标准株、地方株及Gott株的氨基酸序列进行比较，结果见图1、图2和表1。

图1A组轮状病毒P2[6]型地方株BN与同型有毒株与无毒标准株及地方株VP4血清型特异片段VP8的氨基酸序列比较

Figrure 1Comparision of the amino acid sequences of VP8 (specific fragment from VP4 gene) among P2 [6] rotavirus BN field strain and previously published P2 strains recovered from asymptomatic and symptomatic infections

图2A组轮状病毒G4地方株BN与同型(包括A、B亚型)有毒与无毒标准株和地方株VP7氨基酸序列比较

Figure 2