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分类号：S945.4文献标识码：A文章编号：1000-8721(1999)04-0354-06
DEVELOPMENT OF POLYMERASE CHAIN REACTION ASSAY FOR DETECTION OF PENAEUS CHINENSIS NON-OCCLUDED BACULOVIRUS
XU Hong-tao1, PIAO Chun-ai2, WANG Lei1, ZHU Jun-ping1, DONG Jie2,
WANG Chang-an2, XIANG Jian-hai1, JIN Qi2, HOU Yun-de2
(1 Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Shandong, Qingdao 266071, China;2 Institute of Virology, Chinese Academy of Preventive Medicine ,Beijing 100052,China)
Abstract：Penaeus chinensis non-occluded baculovirus(PcNOBV) is the causative agent of the widespread epizootic called white spot syndrome which has caused high shrimp mortality and great economic loss to Chinese shrimp industry. Preliminary research results indicated that PcNOBV belongs to members of white spot syndrome baculoviruses (WSBVs), representing a WSBV isolate from cultured P. chinensis in mainland China. It has been assumed that all of the WSBVs including PcNOBV isolated from P. chinensis in mainland China , PmNOBⅡ from P. monodon in Thailand, PmNOBⅢ from P. monodon and P. japonicus in Taiwan and RV-Pj(=PRDV)from P. japonicus in Japan are closely related and may represent different strains of a same virus. In order to obtain some information on the relationship between the two geographically adjacent PmNOBⅢ in Taiwan and PcNOBV in mainland China, a pair of primers producing 355bp amplification fragment was designed based on the sequence of PmNOBⅢ genome DNA SalⅠ fragment. The expected amplification product was obtained when DNA isolated from purified nucleocapsids of PcNOBV and DNAs from naturally diseased P. chinensis, P. japonicus and P. monodon tissues were used as templates. The detection limit of purified PcNOBV DNA is 3.4 pg. DNA isolated from healthy penaeid shrimps did not yield any amplification product. These results demonstrate that PcNOBV and PmNOBⅢ are homologous at least in part of the genome structure, and that this assay can be used for early, rapid, sensitive and specific detection of PcNOBV infection.
Key words：Penaeus chinensis; Penaeus chinensis non-occuded baculovirus; White spot syndrome baculovirus; Polymerase chain reaction; Diagnosis
白斑征杆状病毒(White spot syndrome baculovirus，WSBV)已使亚洲地区对虾养殖业濒临绝境。养殖对虾白斑征最早于1992年发生于台湾[1]，随后于1993年春季日本养殖的日本对虾(P.japonicus)出现大量死亡[2]。中国大陆沿海地区养殖的中国对虾(P.chinensis)、日本对虾及斑节对虾(P.monodon)于1993年夏开始全面暴发白斑征。目前白斑征杆状病毒已遍布亚洲主要对虾养殖国家和地区，并已传播到北美洲[3，4]。根据所分离毒株的地域分布及原始宿主的不同，各研究者赋予WSBV各分离株不同的命名，包括：PmNOBⅡ[5]、PmNOBⅢ[6，7]、RV-Pj(＝PRDV)[8，9]及PcNOBV[10]。这些病毒所致疾病的共同特征为发病对虾甲壳呈明显白斑，数天内死亡率高达100％。初步研究结果提示，这些病毒可能属同一种病毒或一组密切相关的病毒毒株，因此倾向于将其统称为白斑征杆状病毒[11]。该病毒是目前所报道的所有对虾病毒中毒力最强、危害最大的一种且地域分布及宿主范围广泛，几乎侵染世界上目前所有主要对虾养殖品种，包括斑节对虾、日本对虾、中国对虾、印度对虾(P.indicus)、墨吉对虾(P.merguiensis)、南美白对虾(P.vannamei)、红额角对虾(P.stylirostris)、褐对虾(P.aztecus)、桃红对虾(P.duorarum)及白对虾(P.setiferus)[12]。
中国对虾是中国大陆主要的对虾养殖品种，约占85％；斑节对虾及日本对虾在部分地区也有养殖。自1993年以来连年暴发白斑病，已致重大经济损失。现已证实：PcNOBV(Penaeus chinensis nonoccluded baculovirus)是引起中国对虾暴发性白斑病的主要病原[10]。流行病学资料显示，中国大陆流行的PcNOBV感染暴发有从南到北发展的顺序。从发病时间及顺序分析，此病毒可能与台湾地区流行的PmNOBⅢ有一定关系。为研究二者的相互关系及建立敏感、特异、快速的基因诊断技术，根据PmNOBⅢ基因组SalⅠ片段序列设计一对引物，对纯化的PcNOBV DNA及自然发病的三种对虾组织DNA进行扩增，研究了这对引物扩增反应的特异性和敏感性，现将结果加以报道。
材料与方法
1病虾标本患白斑征中国对虾及日本对虾于1996年6月至8月收集于青岛地区发病虾场；发病斑节对虾于1996年9月收集于广西北海发病虾场。病虾标本冻存于-70℃。
2病毒核衣壳分离纯化按前述方法[10]进行。
3病毒基因组DNA提取纯化病毒核衣壳悬液加蛋白酶K及Sarkosyl分别至0.3mg/ml及1％，56℃过夜；加NaCl至0.7mol/L及0.1倍体积CTAB/NaCl溶液，65℃水浴30分钟，酚、酚：氯仿及氯仿各抽提1次，乙醇沉淀，溶于TE，紫外分光光度计定量，存4℃用作PCR反应模板。
4健康对虾基因组DNA提取健康中国对虾、日本对虾及斑节对虾为本室虾贝遗传组所存，组织DNA按文献[13]所述真核细胞基因组DNA提取方法进行。
5病虾组织PCR模板制备剪取发病对虾鳃组织，加入适量消化液(50mol/L KCL，10mol/L Tris-HCL pH8.5，0.5％NP-40，0.5％Tween-20，0.1mg/ml蛋白酶K，1％Sarkosyl)，吹打混匀，65℃消化1小时，常规酚、酚：氯仿及氯仿抽提，乙醇沉淀，加TE，56℃助溶30分钟，存4℃备用。
6PCR扩增反应引物设计依据PmNOBⅢ基因组SalⅠ片段序列合成，引物1：5＇-ATCAAGACTCGCCCTCTCCA-3＇， 引物2：5＇-GTTGTTCCAAAACATTAGCA-3＇扩增片段长度为355bp。50μl PCR反应混合物内含：引物各50pmol，dNTPs各250μmol/L，MgCl2 1.5mmol/L，Taq DNA Polymerase 2μ，DNA适量。反应在PE-2400热循环仪上进行，循环参数为：94℃变性5分钟；94℃45秒，55℃ 30秒，72℃ 45秒，循环30次；94℃ 2分钟，55℃ 2分钟，72℃ 6分钟，循环1次。反应完毕取8μl进行1.8％琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下分析结果。
7序列测定PCR产物经纯化后连接到pGEMT 载体(Promega产品)，转化致敏菌DH5α，提取质粒DNA，由北京赛百盛生物工程公司进行DNA序列测定。
结果
1病毒核衣壳分离纯化
经氯化铯密度梯度离心后获得纯化的PcNOBV核衣壳(图1)，病毒包膜全部丢失，无细胞成分污染，用于病毒基因组DNA提取。
图1氯化铯密度梯度纯化PcNOBV核衣壳PTA负染标本电镜照片(标尺＝100nm)
Figure 1Electron micrograph of negatively PTA stained PcNOBV nucleocapsids purified by CsCl density gradient(Bar＝100nm)
2PCR检测PcNOBV的特异性鉴定
分别以健康中国对虾、日本对虾及斑节对虾组织DNA，发病中国对虾、日本对虾及斑节对虾组织DNA为模板，经PCR反应扩增，结果显示，以发病中国对虾、日本对虾及斑节对虾组织DNA为模板，根据PmNOBⅢ基因组SalⅠ片段序列设计的引物成功地扩增出长355bp的特异性产物，而健康对虾组织DNA及无模板DNA PCR反应未检出目的扩增片段(图2)。同时对昆虫杆状病毒AcMNPV DNA进行扩增，结果也阴性。
