摘要：以来自哈尔滨传染性法氏囊病病毒(IBDV)强毒株(Harbin毒株，H)的基因组RNA为模板，用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)的方法得到了其A节段的全长cDNA片段，分5＇端(1 659bp)和3＇端(1 444bp)上下两段分别克隆到pGEMB^®-T载体上，测定了其核苷酸顺序，在长为3 101 bp中含有两个阅读框ORF A1和ORF A2，分别编码1 012个氨基酸的前体蛋白(VP2-4-3)和145个氨基酸的VP5，ORF A1和ORF A2有部分的重叠。将核苷酸序列及推测出的氨基酸序列与已报道的IBDV血清Ⅰ型和Ⅱ型毒株的相应序列进行了比较，结果表明：H毒株与其它血清Ⅰ型毒株之间，在核苷酸水平上存在25bp-267bp的差异；在氨基酸水平上存在17～40个氨基酸的差异。在VP2-4-3内比较显示，H毒株与P2、Cu-1之间氨基酸的差异最小为1.7％，H毒株与UK661之间氨基酸的差异最大为3.9％。变异主要发生在VP2的可变区(206-350位氨基酸)，在H毒株所特有的12个氨基酸当中，该区就占5个，代表1.76％的变异。VP4、VP3和VP5区各有两个特有氨基酸的替代，分别代表0.74％、0.69％和1.38％的变异。序列分析显示，H毒株在抗原性和毒力上均存在着变异，然而，它既不同于欧洲、日本和以色列分离的超强毒，也不同于美国的变异株。与其亲缘关系最近的是欧洲的较早期的分离株，但是在可变区，尤其是在两个亲水区又有明显的突变。

中图分类号：S858.31；Q343.1文献标识码：A文章编号：1000-8721(1999)04-0330-09

CLONING AND SEQUENCE ANALYSIS OF SEGMENT A cDNA OF A VERY VIRULENT INFECTIOUS BURSAL DISEASE VIRUS

HU Zi-xin, ZHANG Man-fu

(Department of Molecular Biology and Biochemistry, China Agricultural University, Beijing 100094, China)

Abstract: By RT-PCR, the nucleotide sequences of the Harbin vvIBDV segment A, two ORFS for VP5 and precursor polyprotein were determined. The results showed that the cloned 3101bp segment A gene contains two overlapping open reading frames (ORFA1 and ORFA2). The large ORF of 3036bp encodes a polyprotein (VP2-4-3), whereas the small ORF is 435bp coding VP5. The deduced amino acid sequence of the Harbin strain was compared with those of other serotype 1 and 2 strains. The results showed that the sequence of the Chinese isolate, the Harbin strain, has variations for virulence and antigenecity. There are 25 to 267 nucleotide differences among segment A of Harbin strain and the other serotype I strains of IBDV. The polyprotein encoded by Harbin strain showed 17 to 40 amino acid differences from those of the other serotype I strains, with 12 substitutions unique to Harbin strain. The minimum amino acid divergence within polyprotein (1.7%) was observed among Harbin strain and P2, Cu-1 of serotype 1. The maximum amino acid difference was 3.9% observed between Harbin strain and Uk661. Within the 454 residues of VP2 of Harbin strain, there are 5 amino acid substitutions, representing 1.76% variation at the VP2 variable region between residues 206 to 350. Within the 267 residues of VP4, there are only 2 amino acid substitutions, representing 0.74% variation. Within the 289 residues of VP3, there are also 2 amino acid substitutions, representing 0.69% variation. Within the 145 residues of VP5, there are 2 amino acid substitutions, representing 1.38% variation. Harbin strain is neither similar to the vv strains from Europe, Japan and Israel nor to the variant strains from the United States and China Guanzhou. It is most closely related to the strains isolated earlier from Europe, however has distinct amino acid mutations in variable region, especially in two hydrophilic domains.

Key words: Infectious bursal disease virus; Segment A; Reverse transcription-polymerase chain reaction; Sequence and phylogenetic analysis

鸡传染性法氏囊病(Infectious bursal disease，IBD)是幼鸡的一种高度免疫抑制性疾病，在世界范围内引起了严重的经验损失。IBDV属于双链双节段RNA病毒科，基因组由A和B两个节段组成，包括5＇端非编码区、编码区和3＇端非编码区。A节段(3.3～3.4kb)包括两个完整的阅读框架ORFA1和ORFA2，分别编码VP2-4-3和VP5；B节段(2.8～2.9kb)编码VP1。VP1是病毒RNA聚合酶，它与病毒RNA复制有关。VP2和VP3是病毒的主要结构蛋白，共同构成病毒衣壳，是主要的宿主保护性抗原。VP2是血清型特异性抗原，VP3为群特异性抗原。抗原变异主要发生在VP2的可变区，VP4在病毒蛋白成熟过程中起重要作用，VP5功能目前尚不清楚^[1，2]。

近年来在欧洲和亚洲由于超强毒(vvIBDV)的出现，该病毒已经成为包括中国在内的世界性引起养鸡业经济损失的最重要病原。然而，vvIBDV高致病性的分子基础及其起源尚不完全清楚。本研究旨在对中国近年分离到的强毒IBDV-H毒株进行分子结构分析。通过反转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增A节段的cDNA基因，在克隆和序列分析的基础上，与已报导的Ⅰ型毒株、变异株及Ⅱ型毒株的A节段序列进行比较，构建系统发育树，进而从分子结构上来确定IBDV-H毒株的抗原和毒力的基础，寻找vvIBDV的起源；通过分析IBDV-H毒株和其他Ⅰ型毒株、变异株及Ⅱ型毒株的相互关系，更好地理解病毒的传播方式。不同国家和地区IBDV毒株之间差异的鉴定，可以帮助我们建立准确的诊断方法，正确地使用疫苗，也为研制开发新的有效的疫苗打下基础。

材料与方法

1IBDV-H毒株由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所陈冠春等于1992年从哈尔滨地区某鸡场的病鸡法氏囊中分离得到，是近年来在中国大陆分离的典型强毒之一。故选该毒株经4周龄SPF雏鸡繁殖作为实验材料。

2病毒纯化和病毒基因组dsRNA的提取以IBDV-H毒株接种4周龄SPF雏鸡，接种后96小时收取法氏囊，以超速离心纯化病毒后，用酚-氯仿抽提提取病毒RNA^[1]。

3RT-PCR引物设计参见文献^[2]。

4病毒基因组dsRNA的反转录和聚合酶链反应(PCR)以病毒基因组dsRNA为模板，以P1为引物，按Gibco BRL superscript preamplification system提供的方法，合成了全长A节段cDNA，以此cDNA为模板，利用PCR反应，按Gibco BRL Enlongase polymerase提供的方法，放大扩增得到有部分重叠的上下两段PCR产物，其长度分别为1 659bp(37～1 696)和1 444bp(1 689～3 133)。

5cDNA克隆和序列分析将上下两段PCR产物分别进行纯化，再克隆到pGEMB^®-T载体(Promega Co.)上，选取经酶切及PCR鉴定后的阳性克隆进行序列测定。采用渐进法(prime walking)，即5＇端和3＇端分别先用通用引物进行反应，而后依据两端测出序列，另外设计中间段测序引物，再进行测序反应，共计7段结果拼接出A节段全长cDNA序列。为保证测序结果的准确，全部测序反应重复两次。测序时模板的制备采用PEG法，利用ABI377自动测序仪。

6序列编辑和分析利用DNAsis(HITACHI SOFTWARE.ENGINEERING CO.LTD，1991)、GeneDoc(Nicholas，K.B.，Nicholas H.B.Jr.，and Deerfield，D.W.Ⅱ.1997)和DNASTAR(DNASTAR，INC.Madison，Wisconsin.Fourth Edition，October 1997，12)等软件，对所测定的IBDV-A节段的核苷酸序列及推测出的氨基酸序列进行编辑，并与已报道的IBDV血清Ⅰ型和Ⅱ毒株的相应序列进行同源分析。比较时所引用参考序列及其Genbank接受号包括：Ⅰ型，Harbin AF092171、UK661 X92760、OKYM D49706、52/70 D00869、Cu-1X16107、P2 X84034、STC D00499、GLS M71346、GZ29112 AF051837、002-73 X03993；Ⅱ型，OHM66722、23/82 Z21971^[3-9]。

结果

1IBDV-H毒株A节段的序列分析

用RT-PCR方法得到了IBDV-H毒株A节段的全长cDNA，分5＇端(1 659bp)和3＇端(1 444bp)上下两段分别克隆到pGEMBR-T载体上，测定了其核苷酸顺序。为了保证结果的正确性，所有测序反应重复两次。使用DNAsis和DNASTAR软件分析显示，在长为3 101bp核苷酸序列中，含有两个阅读框ORF1和ORF2，分别编码1 012个氨基酸的前体蛋白(VP2-4-3)和145个氨基酸的VP5，ORFA1和ORFA2有部分的重叠。整个序列既没有缺失也没有插入。此核苷酸序列已被GenBank收录，接受号是AF092171。

图1列出了12个毒株的ORF A1氨基酸序列的比较，包括超强毒UK661、OKYM和Harbin，经典Ⅰ型毒株52/70、Cu-1、P2、STC和002-73，变异株GLS和GZ29112，以及血清Ⅱ型毒株23/82和OH。与其它血清Ⅰ型毒株相比，H毒株在核苷酸水平上有25～267个核苷酸的差异；在氨基酸水平上，有17～40个氨基酸的差异，其中有12个氨基酸为H毒株所特有，它们分别位于19(P)、129(L)、178(G)、213(G)、216(L)、267(G)、290(S)、300(G)、606(R)、611(H)、917(L)和985(M)；其中8个是在VP2；5个在可变区；2个(606和611)在VP4；2个(91