摘要用外周血单个核细胞混合培养法分离到的HIV-1 SH01株，具有典型的HIV颗粒的形态学特征，核心颗粒呈锥形，可见芽生释放的全过程。偶尔可在胞装空泡内见到HIV颗粒，同时还有细胞碎片和溶酶体结构，故此类空泡实际为HIV吞噬泡。另一少见的现象是溶酶体摄取并消化HIV颗粒，在HIV-1 SH01株感染7天或持续感染的MT4细胞中均可见到，后者尤为普遍。在HIV-1 SH01株持续感染的MT4转化细胞中，经过溶酶体消化的HIV残体依稀可见，但同时也存在吞噬溶酶体膜溶解的现象。可见，非特异性免疫在清除体内HIV方面的作用值得作进一步的研究。此外，在HIV-1 SH01株感染7天的MT4细胞的胞浆基质中，还可见到一种类病毒样颗粒，其性质有待进一步确定。

中图分类号：R512.91; Q934.2文献标识码：A 文章编号：1000-8721(1999)04-0305-09

MORPHOLOGY AND MORPHOGENESIS OF HUMAN IMMUNODEFICIENCY VIRUS-1 ISOLATE, SH01 IN MT4 CELLS

LI Guan-han, WANG Mei-hua, JIN Zhi-cheng, PAN Qi-chao, KANG Lai-yi

(HIV Laboratory, Shanghai Center of Disease's Control and Prevention, Shanghai Municipal AIDS Surveillance Center, Shanghai 200336, China)

Abstract: An HIV-1 strain, SH01, isolated by coculture of peripheral blood mononuclear cells (PBMC) was easily passaged in MT4 cell line and multinuclear giant syncytia could be induced in MT2 cells. It was a syncytium-inducing (SI) T-cell-tropic isolate. Electron microscopy showed this isolate shared the typical features of HIV-1 in morphology, such as conical core, variation in size and budding release from cell membrane. A distinct fact was that HIV particles could be found in cytoplasmic vacuoles in MT4 cells infected at 7th day or trasformed persistently with HIV-1 SH01, but cell debris or lysosomes were seen at the same time. So these vacuoles were phagosomes or endocytic vacuoles rather than dilated vesicles of Golgi apparatus or endoplasmic reticulum. Furthermore, a large number of HIV particles were also found by chance in phagolysosomes in HIV-1 SH01-infected MT4 cells at 7th day, but it was quite common in HIV-1 SH01-transformed MT4 cells and the remnants of HIV particles were located in some phagolysosomes, yet the dissolution of phagolysosome membrane could be demonstrated simultaneously. Conclusively, it is evident that HIV particles were taken in by MT4 cells through endocytosis and digested by lysosomes, so the role of lysosomes should be paid attention to more extensively in the clearance of HIV in human body. In addition, a kind of virus-like particles was located in cytoplasmic matrix rather than in vacuoles or vesicles, which were more diversified in size with cores bigger, circular or oval and possibly produced from Golgi apparatus, but their characteristics needs to be further determined.

Key words: Human immunodeficiency virus-1 (HIV-1) SH01; Morphogenesis; Phagolysosome

人类免疫缺陷病毒(HIV)是慢病毒属(lentivirus)中典型的C型病毒，与同属的其他病毒比较，其非对称的锥形核心颗粒为其最重要的形态学特征之一^[1，2]。形态发生学研究表明，HIV主要以芽生的方式释放至细胞外，刚从细胞膜脱落的HIV颗粒尚无典型的锥形核心颗粒，核心颗粒的成熟是在释放之后较短的时间内完成的^[1-5]。但是，根据宿主细胞的不同，HIV亦可释放至胞浆的内质网腔或高尔基体腔，成为空泡内病毒^[2，6-13]，甚至于形成包涵体^[11]。本实验室于1994年底至1995年初从本市的一名曾去非洲莱索托从事劳务活动的HIV-1感染者中分离到一株病毒，即HIV-1 SH01，为合体细胞诱导型(SI)T细胞敏感株^[14-16]。超微结构和形态发生学研究显示，此毒株在MT4细胞除具有HIV-1的共同特征外，还可观察到HIV的吞噬泡及溶酶体摄取并消化HIV颗粒的现象，在胞浆基质中尚可观察到一种病毒样颗粒。

材料与方法

1HIV-1的分离及检测

HIV-1的分离：从一名曾在莱索托从事劳务活动一年半的HIV-1感染者中抽取新鲜血液10ml，加肝素(20单位/ml)抗凝。经Hank’s液双倍稀释后，以Ficoll-Hypaque液分离并收集外周血单个核细胞(PBMC)，然后与经PHA刺激3天的正常PBMC混合。在含20％NCS、10％～20%IL-2和抗菌素的RPMI 1640中继续培养。每周补充PHA激活的正常PBMC1次，换液2次。 间接免疫荧光法(IFA)：常规制备细胞涂片，以HIV-1阳性血清为一抗，FITC兔抗人IgG(Dako公司)为二抗，进行常规荧光染色并观察。

HIV-1 P24抗原测定：采用Vironstika半定量ELISA试剂盒测定PBMC共培养上清的HIV-1 P24抗原。

蛋白印迹法(Western blot)：HIV-1毒株的裂解抗原，经聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳后，将抗原转移至硝酸纤维膜，并以5％脱脂奶作封闭。转移膜相继在1：100 HIV-1阳性血清及1：100 HRP羊抗人IgG中孵育，DAB-H₂O₂显色，清水中止反应。

2HIV-1分离株的转移和传代将PBMC共培养上清反复感染MT4、H9、Molt4/clone8细胞，并做IFA。HIV-1分离株转移到MT4细胞之后，继续换液培养，使少量存活细胞成为HIV-1持续感染的转化细胞。将该毒株感染的MT4细胞培养液再感染H9、Molt4/clone8和MT2等细胞，并观察各种细胞的病变情况。

3电境观察取HIV-1分离株感染7天的MT4细胞、持续感染的MT4转化细胞和正常MT4细胞悬液各10ml，置尖底管中，以4 000r/min离心10分钟，去上清。在4℃经2.5％戊二醛固定24小时后，以1％锇酸后固定。乙醇-丙酮梯度脱水，618环氧树脂包埋，制超薄切片，以醋酸双氧铀和枸橼酸铅染色，在JEM-1200EX透射电镜中观察。

结果

建立PBMC共培养之后，每周进行IFA染色，并检测共培养上清的P24抗原。第22天P24抗原阳性，第6周IFA染色明显阳性，此分离株即HIV-1 SH01。将共培养上清反复感染MT4等细胞，5周后此毒株成功转移至MT4细胞，并出现细胞病变，表现为细胞固缩、崩解和气球样细胞。继续培养HIV-1 SH01/MT4细胞，少数未完全病变的细胞逐渐恢复正常形态，成为此毒株持续感染的转化细胞。将HIV-1 SH01/MT4细胞的培养上清感染H9、Molt4/clone8、MT2和CEM-ss细胞，除H9细胞外，其他细胞均相当敏感。蛋白印迹法分析显示，该毒株的抗原特征与HIV-1 Ⅲb基本一致^[14]。

HIV-1 SH01具有HIV的典型形态特征，呈圆形或椭圆形，核心颗粒为锥形，根据切面的不同亦可表现为杆状或圆形。病毒颗粒直径一般在80～150nm之间，最大的达175nm，大小不一的特征明显(图1，a)。可观察到典型的HIV颗粒自胞膜芽生释放的全过程。出芽处胞膜起初呈新月形隆起，逐渐成半圆形、圆形，最后成完整的病毒颗粒而脱落，有的即将脱落的病毒颗粒仍通过纤细的桥样连接与细胞膜相连(图1，b)。刚释放到细胞外的病毒颗粒外膜有刺样突起，核心颗粒常缺如，此为未成熟的HIV颗粒。

图1(a)HIV-1 SH01大小不一的特征明显，核心颗粒呈锥形、杆状或圆形。(b)HIV-1 SH01从胞膜出芽释放过程的各个阶段均可见到，一即将脱落的HIV颗粒仍通过纤细的桥样连接与细胞膜相连。

Figure 1 (a) HIV-1 SH01 particles varied in size with conical, tubular or circular cores. (b) The whole budding process of HIV-1 SH01 was shown and an HIV particle was still connected to cell membrane by a fine bridge-like linkage.

本研究中，偶尔也可在HIV-1 SH01感染的MT4细胞的胞浆空泡内见到HIV颗粒(图2，a)，并且在感染7天或持续感染的MT4细胞中均能见到。在有的空泡内，HIV颗粒还相当多见，且形态十分典型，不过除HIV颗粒外，还有细胞碎片和溶酶体结构(图2，b)。可见，此类空泡实际上是HIV的吞噬泡。在HIV-1持续感染的MT4转化细胞中，所见的一HIV吞噬泡位于细胞膜附近，可能是通过吞饮作用刚形成不久的吞饮泡(图2，c)。

图2(a)在HIV-1 SH01感染7天的MT4细胞中，一胞浆空泡内可见HIV颗粒和细胞碎片。(b)在同一标本的另一空泡中，存在大量的HIV颗粒，核心颗粒的锥形特征明显，同时溶酶体和细胞碎片亦清晰可见。(c)在HIV-1 SH01持续感染的MT4转化细胞中，一已摄入HIV颗粒的空泡位于细胞膜附近，可能是刚形成不久的吞饮泡。

Figure 2(a) HIV particles and cell debris were found in a cytopla