摘要：分子生物学的发展与进步,聚合酶链反应(PCR)技术已成为分子生物学领域研究中不可缺少的核心技术。为满足生物学特别是临床医学的要求,特异性核酸定量的研究近年有很大发展。

一、核酸定量概述以往核酸定量(又称QPCR)包括蛋白印迹,由于敏感性低而不能检出基因的微小变异。而PCR技术可以克服以上方法学的缺点,分析极微量的DNA,无论以哪种标本为模板,均可以扩增并定量分析。因为PCR过程是一种指数增长过程,反映参数(Taq酶的活性,Mg++浓度,温度及循环次数的选择,引物二聚体形成和污染DNA的存在等)的任何一个微小变化都会显著影响产物的量。在全部精确优化的条件下,试验中还会由于试管效应而产生产物量上的差异。准确QPCR的焦点在于如何去除影响因素。

二、参比法定量技术最早定量PCR多采用参比法[1],参照基因与待研究基因在同时反应,早期有内参照半定量PCR及外参照法,但由于准确度达不到要求,或未考虑试管效应的误差而趋于淘汰。目前如仍用内参法(CPCR),即参照基因和靶基因竞争相同引物,须以相同效率扩增,多数反应是采用倍比稀释的已知浓度参照,与恒定量靶基因一起扩增,检测两者扩增后,以参照基因的起始拷贝为横轴,参照基因/靶基因产物比值为纵轴,作图得曲线,纵轴为1的点对应的拷贝即为靶基因的拷贝数。

三、板式杂交定量技术目前,PCR多以扩增产物来定量靶基因的量,可分为扩增中不标记与扩增中有标记两大类。所谓扩增中不标记方法,是以扩增后的电泳区分,以密度扫描仪扫溴化乙啶(EB)染色凝胶而定量,或以带标记的探针再去杂交,检测标记物,间接推断靶基因量。所谓扩增中有标记法,即标记引物或dNTP而进行检测。以下将介绍目前较常用的酶免疫法(EIA)板式杂交[2]及荧光定量(FQ)-PCR检测[3]。

板式杂交定量1.PCR产物微孔板杂交法:成功地将PCR技术、核酸杂交技术及酶联免疫技术结合起来,开拓了分子杂交新领域。其基本原理是通过一定的方法将PCR产物固定于聚苯乙烯微孔板上,再将特异的探针加入孔中进行分子杂交,最后加入与探针上标记物相应的酶标配体,利用酶联免疫技术达到检测信号的目的。

2.反向板式杂交法:首先将特异的寡核苷酸探针作为捕捉探针,固定于微孔板上,再将带有标记的PCR产物加入孔中进行分子杂交,最后加入与标记物相应的酶标配体,进行酶免疫(EIA)检测。此法多用于PCR产物的突变和亚型分析,以及多引物对介导的PCR产物的鉴定。

3.夹心杂交法:该法是通过一固定于微孔板上的捕捉探针,与PCR产物的某一区域特异杂交,使产物间接固定于微孔板上,然后再用一检测探针以产物的另一区域杂交,漂洗后显色即可判断结果。该法由两个杂交过程来检测一个产物,因此特异性较一次杂交要强,研究表明该法用于乙型肝炎病毒(HBV)检测,敏感性可达5个HBV DNA病毒分子。

板式杂交方法在临床实验室应用具有以下优点:(1)容易操作,稳定性好,试剂容易购得;(2)无放射性污染及溴化乙啶污染;(3)仪器读取数据结果客观,避免主观干扰;(4)杂交过程短,便于同时大量样本检测,便于临床常规应用和流行病学研究中筛选样本;(5)敏感性高,大于琼脂糖凝胶电泳10倍以上,其敏感性和特异性与PCR32p探针的Southern杂交法相当;(6)可进行PCR产物的定量或相对定量;(7)可实现自动化。

在这一技术中,微孔板DNA固定技术是很重要的。DNA或寡核苷酸可以在一定离子浓度下直接固定,也可通过蛋白质物质作为桥梁包被于微孔板上,或对微孔板表面进行某种化学修饰,其表面带有某种化学基团。该基团与核酸分子上的相应基团通过共价键形式连接,从而将DNA或寡核苷酸固定在板上。其具体方法例举如下。

无机盐直接DNA固定法:PCR产物在一定的NaCl或(NH4)2SO4浓度下,37℃过夜即可被直接固定在微孔板上。当盐浓度适当时,DNA一端固定到板上,盐的浓度则根据微孔板来源和产物的大小而有所不同;盐浓度过低或过高可能使DNA"平躺"固定在孔内而影响杂交,用此法固定的DNA,其长度应大于300bp,否则影响杂交结果。

蛋白质桥梁固定法:该法的基本原理是将一蛋白质预先包被在微孔板上(这种连接是非共价键形式),通过核酸分子上标记的相应配体与板上的蛋白质物质结合而固定核酸。目前最常用的是亲和素(avidin)或链亲和素(streptoavidin)与生物素(biotin)系统,先将亲和素或链亲和素包被在孔内,加入标记有生物素的特异探针。由于亲和素和生物素间的亲和力大,特异性强,因而核酸固定的效率较高。研究表明,以链亲和素与生物素固定探针进行的杂交,阳性阴性比值(P/N)可达24.6。另外,也可以对PCR中的一条引物的5'端修饰生物素,或PCR中掺入Biotin-dUTP,这样核酸分子的一端或链中带有生物素,加入孔中即特异地与板上的亲和素结合,从而将产物固定,然后用特异的探针进行杂交,此法P/N值可达36.4。

共价连接:理想的DNA固定方法是以共价键形式将DNA分子的一端固定于固相载体上,这种连接形式最早是由Ghosh等建立的,选用的载体有乳胶颗粒、磁珠等。1991年,丹麦生产出一种新型微孔板,其表面连接有一氨基基团,核酸末端的磷酸基可与氨基在碳二亚氨作用下发生缩合反应形成磷酰氨键。合成引物时,在5'端修饰一磷酸基团,PCR扩增后DNA的2条链中有1条链上带有磷酸基,即可固定产物。

四、荧光定量技术该法融合了PCR及DNA探针杂交的优点,直接探测PCR过程中信号的变化,根据PCR反应酶动力学特点,以获得DNA模板的准确定量结果,这一点是比EIA法更为成功的一部分。其试验原理是:在普通PCR扩增系统中,加入一个与靶基因序列特异互补的双荧光标记探针。探针的5'端标记荧光发射基团,3'端标记荧光淬灭基团,当探针完整时,由于淬灭基团的淬灭作用,荧光报告基团受到抑制不能产生荧光发射,当有靶基因存在时,在PCR的复性阶段,标记探针即与靶基因互补结合,在PCR的延伸期,引物沿模板延伸至标记探针结合部时,由于DNA聚合酶(Taq酶)具有5'-3'的外切酶活性,将探针5'端荧光报告基团切下,从而荧光报告基团淬灭作用解除。产生荧光发射,其荧光信号强弱与PCR产物量成正比关系,通过荧光光谱分析仪检测荧光强度,即可测知扩增产物的量。

另外也可在同一反应体系中加入2种以上针对不同靶基因的序列问,各探针分别用不同波长荧光素(即荧光报告基团)标记。当反应体系中有某种靶基因就显示某种波长的发射荧光。

关于这种荧光测量如何反映模板量的问题,其原理主要根据免疫荧光的特点,避免平台现象,以原始模板量加减一定倍数的标准差为阈值,利用达到该阈值的循环次数,可以较为准确地推断原始模板的量。

我国已研制了封闭式荧光定量PCR检测试剂盒,其特点:(1)可准确对样品靶基因定量检测。(2)由于整个扩增产物的检测是在封闭状态下进行,可以避免扩增产物假阳性产生的污染,免除PCR后处理,易于操作。(3)可以用不同波长荧光素标记不同探针,利用多重PCR检测。(4)定量范围较宽,操作时无梯度稀释。(5)光谱分析技术较灵活,可使用仪器判读,元论全自动或半自动仪器,读数后均可得到定量结果。(6)使用实时检测可精确定量,终点法检测可一般定量或半定量。

在FQ-PCR中,还可更进一步利用荧光偏振定量检测,或采用直接标记双链荧光素方法进行检测时,则又有更多优点。 国外最近对模板定量技术进一步改进,在模板上标记过量的荧光基团,并且让其处于非激活状态。在反应过程中,引物结合后使荧光基团激活,使用较复杂的仪器系统,对荧光进行实时检测,并绘出荧光曲线,可直接计算模板量。国内学者采用了更精密的设计,用巢式扩增技术,在一定条件下,控制循环数,利用外引物对模板第1次扩增,然后在另外参数下,控制循环数,利用内引物第2次扩增,扩增中内引物的一条链标记生物素系统,另一条链标记荧光系统,并通过带标记的荧光抗体再次扩增。该系统在设计上要求极高,并可进行一次性全封闭实时检测得到精确定量。该法操作简便、准确,但设备较为昂贵。

总之PCR的定量检测技术还在发展中,它的使用无疑将使核酸检测进入更高一级,更实用的阶段。它的临床应用将帮助我们对疾病病程的了解、观察疗效、估计预后等方面提供更多有参考价值的材料。

参考文献

1王申五.基因诊断技术.北京:北京医科大学中国协和医科大学联合出版社,1993.106-107.

2魏军,张正.聚合酶链反应微孔板杂交技术.中华医学检验杂志,1997,20:252-254.

3 Rasmussen R,Morrbon T,Hermann M,et al.Quantitative PCR by continuous fluorescence monitoring of a double strand DNA specific binding dye.Biochem,1998,2:8-9.

4 Silva DD,Reiser A,Herrmann M,et al.Rapid genotyping and quantification on the light cyclerTM with hybridization probes.Biochem,1998,2:12-13.

5郑怀竞,0主编.基因扩增临床检验指南.北京:北京医科大学中国协和医科大学联合出版社,1998.55-62.

(收稿:1999-03-15修回:1999-05-21)

(本文编辑:臧焰)