西北国防医学杂志2000年第21卷第4期

蒙育林叶江枫何晋张国成

关键词：实验室诊断；人细小病毒B19；实体瘤；PCR

人细小病毒B19(human parvovirus B19，HPV－B19)是细小病毒家族成员之一。1975年C ossar t首先在健康献血员血清中发现了HPV－B19，1981年Pattison和Sergeant分别证实了镰状细胞 病合并一过性再生障碍危象与HPV－B19感染的关系，此后有关该病毒与人类疾病关系的报道日 渐增多。我们用巢式多聚酶链反应(PCR)技术对46例儿童恶性实体瘤组织作了B19－DNA检测，探讨HPVB19感染与儿童恶性实体瘤的关系。

1材料和方法

1．1材料：实体瘤标本取自第四军医大学西京医院和西安市儿童医院病理科1994～1998年病理档案的石蜡包埋组织。恶性实体瘤组46例(肾母细胞瘤17例、神经母细胞瘤14例、髓母细胞瘤11例、恶性淋巴瘤4例等)，男30例，女16例；年龄2～13岁。取同期非肿瘤小儿手术切除组织26例作对照。

1．2试剂

1．2．1病毒来源：HPV－B19质粒来自沙 特皇家医院研究中心(KFSH research Center),经提纯后含量为70 mg·L^－1。

1．2．2引物：按文献^［1］方法 合成，第一对引物IS对应于B19－DNA碱基位置为2905－2924，2A对应于4016－3997，循环后产物为1 112 bp，引物碱基顺序为IS：5′－C t TTAGGTATAGCCAACTGG－3′；2A：5′－ACACTGAGTTTACTAGTGGC－3′；第二对引物3S对应于B19－DNA碱基位置为3187－3206，4A对应于3290－3271，产物为104 bp，引物碱基顺序为3 s：5′－CAAAAGCATGTGGAGTGAGG－3′；4A：5′－CCTTATAATGGTGCTCTGGG－3′。

1．2．3其它试剂：Tag DNA聚合酶，4× dNPTs，10×PCR buffer和琼脂糖(美国Perkin e lmer Cetus公司)，蛋白酶K(美国Merck公司)，PGEM Marker，(华美生物工程公司)。

1．3标本处理及DNA提取

1．3．1石蜡包埋块切成10 μm厚组织片，经正辛烷脱蜡，无水乙醇脱脂，SDS及蛋白 酶K裂解消化，酚、氯仿异戊醇抽提，无水乙醇沉淀，750 ml·L^－1酒精冲洗沉淀片 ，晾干后用pH 8.0 TE(10 mmol·L^－1，Tris，HCl，1 mmol·L^－1 eDTA)溶解 ，－20℃保存待检。

1．4巢式PCR扩增B19－DNA方法同^［1］：50 μl反应体系中双蒸水36μl，10× PCR buffer5 μl，10 mmol·L^－14×dNTPs 1 μl，Tag酶1 u，外引物1 S，2A各 300 ng，模板5 μl(阳性对照1 μl，阴性对照以双蒸水作模板)，混匀后用石蜡油30μl覆 盖。PCR循环条件为：93℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 1 min，35个周期后72℃充分延伸10 min，取第一次扩增产物5 μl为模板， 以内引物3S，4A代替外引物，同上述反应体系及条件进行第二次PCR循环。

1．5结果观察：取第二次 PCR循环产物10 μl与2 μl溴酚蓝混合，加样于含溴化乙锭(EB)的20 g·L^－1琼脂糖凝胶电泳30 min，紫外分析仪上观察，104 bp处出现金黄色电 泳带者为阳性。

1．6统计学方法：χ² 检验。

2结果

小儿恶性实体瘤组HPV－B19 DNA阳性率19.6％(9／46)，其中肾母细胞瘤23.5％(4／17)、神经母细胞瘤14.3％(2／14)、髓母细胞瘤18.2％(2／11)、恶性淋巴瘤25％(1／4)，非肿瘤组 hPV－B19 DNA全部阴性，恶性肿瘤组HPV－B19 DNA阳性率显著高于非肿瘤组(P＜0.05)，4种肿瘤组织均可检出HPV－B19 DNA。

3讨论

病毒感染是肿瘤发生发展的一个可能病因，HPV－B19感染是否与儿童恶性肿瘤的发生相关，至今尚未明了，Gray A^［2］用PCR法检测了39例成人睾丸肿瘤组织，HPV－B19－DNA阳 性率高达85％(33／39)。作者认为HPV B19在成人睾丸肿瘤形成过程中起重要作用或对肿瘤细胞有亲嗜性。我们用巢式PCR技术对46例儿童恶性实体瘤组织作了B19－DNA检测，发现HPV－B19 阳性率为19.6％，显著高于非肿瘤组，证实儿童恶性实体瘤组织存在HPV－B19感染，提示HP v－B19对肿瘤细胞有亲嗜性，HPV－B19感染可能与肿瘤的形成相关。然而现已知有些细小病毒(如腺相关病毒、鼠的细小病毒)^［3，4］有抗肿瘤作用，而HPV b19是否有抗肿瘤 作用有待进一步研究。

作者简介：蒙育林(1966-)，男，硕士，主治医师蒙育林(兰州军区乌鲁木齐总医院，新疆乌鲁木齐830000)

叶江枫(兰州军区乌鲁木齐总医院，新疆 乌鲁木齐830000)

何晋(兰州军区乌鲁木齐总医院，新疆 乌鲁木齐830000)

张国成(第四军医大学 西京医院，陕西 西安710032)

参考文献：

［1］Musiani M,Azzi A,Zerbini M,et al.Nested polymerase chain reac tion assay for the detection of B19 parvovirus DNA in human immunodeficiencyvi rus patients［J］．J MED Virol,1993,40(2):157－160．

［2］Gray A,Guillou L,Zufferey J,et al.Persistence of parvovirus B 19 DNA in testis of patients with testicular germ cell tumours［J］．J Gen Virol,1998,79:573－579．

［3］Hermonat PL.Down-regulation of the human c-fos and c-myc proto -oncogene promoters by adeno-associated virus Rep78［J］．Cancer Lett,1994,81( 2):129－136．

［4］Anouia F,Wattiez R,Mousset S,et al.The cytotoxcity of parvovi rus minute virus of mice nonstructural protein NS1 is related to changes in the syntheis and phosphorylation of cell proteins［J］．J Virol,1997,71(6):4671－467 8．