中华传染病杂志2000年第18卷第1期

缪晓辉孔宪涛戚中田

摘要目的建立一种在微量反应板上进行乙型肝炎病毒(HBV)基因杂交定量分析的技术。方法利用人工合成的多组寡核苷酸探针与乙型肝炎病毒全基因组在微量D nA结合板上进行杂交反应，并利用自制的标记放大探针检测杂交信号，信号值以A值标示，与标准曲线比较后，可求得待测标本中HBV基因含量。结果(1)本方法可直接从血清标本中对HBV定量，可定量范围为20pg～20 ng/ml；(2)不与人类基因组及其它病毒或细菌基因组非特异杂交；(3)定量分析全程5小时 左右。结论微反应板酶联夹心杂交定量技术灵敏度较高、特异性强、操作简便，可用于HBV基因定量检测。

关键词：肝炎病毒，乙型；杂交；定量分析

乙型肝炎病毒基因(HBV 脱氧核糖核酸有重要的应用价值。类似于ELISA的酶联杂交HBV基因定量技术，其基本原理是核酸的两条链具有互补性，用各种标记探针可以与互补链特异结合，通过酶促反应信号的强弱获悉待测核酸量。在操作方法上，除对杂交反应温度的要求比较严格外，余均无特殊^［1～3］。因此，酶联核酸杂交定量技术的建立，无论从其自身应用价值，还是从减轻临检人员工作负担的角度考虑，均有广泛的应用前景。我们按照adr亚型HBV 脱氧核糖核酸和合成了多组寡核苷酸探针，并采用我们制备的信号放大探针，建立了微量反应板酶联夹心杂交HBV 脱氧核糖核酸方法。

材料和方法

一、主要材料

(一) HBV 脱氧核糖核酸DR-1脱氧核糖核酸HBV全基因经BamH Ⅰ酶切后克隆至pBR322载体［4］。

(二) 高分子量脱氧核糖核酸Gibco-BRL产品。

(三) 链亲和素-碱性磷酸酶复合物(Sav-Ap)Gibco-BRL产品。

(四) 微量条排反应板Corning Costar公司生产。

(五) 生物素化信号放大探针(Pd) 本室制备。

(六) 酶联杂交检测缓冲液及配方1. 结合缓冲液(Bb)：50 mmol/L Na₂HPO₄，1 mmol/ L EDTA，0.02% NaN₃，pH8.5。2.20×SSC：3 mol/L NaCl，0.3 mol/L枸橼酸钠 。3. 2×杂交缓冲液：10×SSC，0.1 mg/L鲑鱼精脱氧核糖核酸aN₃，2.0% BSA，0.04% S DS。4.马来酸盐缓冲液：0.1 mmol/L马来酸，0.15 mol/L NaCl，pH 7.5。5. sav-Ap 缓冲 液：马来酸盐缓冲液中含：3% BSA，0.05%吐温-20，0.02% naN₃。6. 洗涤液Ⅰ：2 ×SSC，含0.1% SDS。7. 洗涤液Ⅱ：马来酸盐缓冲液中含0.05%吐温-20。8. aP底物(pNPP) 缓冲液：30 mmol/L三乙醇胺，1 mmol/L MgCl₂。

二、实验方法

(一) 制备HBV 脱氧核糖核酸. HBV 脱氧核糖核酸和纯化：按我们实验室常规进行。2.质粒鉴定和定量：采用琼脂糖凝胶电泳与定量标准品对比法及紫外分光光度计法。

(二) 探针设计与合成1. 捕获探针(Pa)：由21个核苷酸(nt)组成，5′端用氨基修饰。2.夹心探针：根据HBV基因组较为保守的S和C区基因负链序列，用寡核苷酸设计软件(Oligo5. 0)，设计了两组夹心探针。第一组夹心探针(Pb10)：共10套(长度均为41nt)，每套探针3′端方向21nt序列与捕获探针互补，5′端方向20nt序列与HBV 脱氧核糖核酸负链特定区域互补；第二组夹心探针(Pc15)：共15套(均为42nt)，5′端方向的20nt与HBV负链互补，3′端方向 的20nt与放大探针的5′端单链区互补。上述探针由赛百盛生物工程公司合成。

(三) 定量杂交及信号检测方法1.捕获探针与第一夹心探针在反应板外杂交：取等摩尔数 Pa和Pb10，于58℃杂交1 h，然后用乙醇沉淀，沉淀物用Bb溶解，命名为Pab，分装后-40℃保存。2. 包被：用Bb稀释Pab成一定浓度，加入微反应板，50μl/孔；置37℃1 h，或4℃ 过夜；弃去包被物，用封孔膜封闭反应板，置4℃备用。3.夹心杂交：双蒸水或TE稀释HBV d NA标准品至一定浓度，100℃解链10 min，与已用2×杂交液稀释的Pc15等体积(各25μl)加 入反应孔内；封孔后置55℃，2.5 h，或过夜；弃杂交反应物，用洗涤液Ⅰ洗3次，拍干。4. 放大探针与第二夹心探针杂交：用1×杂交液稀释Pd至3 pmol/L，每孔加50μl，置板于52℃ 30 min，然后用洗液Ⅰ洗3次，拍干。5. 信号检测：用Sav-AP反应液按1∶1000 稀释Sav-AP复合物，然后取50μl加入反应孔，置37℃ 20 min，用洗涤液Ⅱ洗4次，拍干后加50μl pNPP，置37℃，2h后直接读取405 nm A值。

三、统计学方法

Student's t检验。

结果

一、夹心杂交检测条件的优化实验结果

(一)捕获探针的反应孔结合量与检测灵敏度的关系分别设定Pab浓度为4000、2 000、1 000、500、250、125 pmol/ml，包被后分别与1 000、100、10、5、2.5pg hBV 脱氧核糖核酸交，固定其它检测条件，包括杂交温度、杂交时间、其它杂交探针浓度等。结果捕获探针浓度为500 pmol/ml，即25 pmol/孔时，灵敏度较高。

(二) 夹心杂交的最佳反应温度根据每套探针的Tm值，预计最佳杂交温度在55℃，我们在55℃左右选择了多个杂交温度，其它条件固定，结果杂交反应温度以56℃为最佳。

(三) 夹心杂交反应的最佳时间我们选择2～12 h之间共8个反应时间，固定其它反应条件。结果发现，2h可达到最大杂交，延长杂交时间，特异杂交信号不进一步增加。

(四)生物素化信号放大探针的放大效果及最佳检测条件将放大探针的工作浓度设定为5 p mol/ml，分别检测100、10、1 pg/孔HBV脱氧核糖核酸无明显差别。放大探针与夹心探针的最佳杂交温度为52℃，最佳工作浓度为1 pmol/ml。

二、定量范围、灵敏度及标准曲线

由标准曲线可见(图1)，本方法定量检测HBV 脱氧核糖核酸20 pg～20 ng/ml，但灵敏度可达 到2 pg/ml。

图1标准曲线

三、特异性和精确度

分别将pBR322载体、pGEM载体、HCV cDNA及蚊虫基因组cDNA解链后进行杂交反应，均未检出阳性信号；对1份慢性HBV感染者血清标本(用竞争聚合酶链反应法检测，HBV脱氧核糖核酸 1 000 pg/ml)，在3个月内进行了9次酶联夹心杂交检测，求得CV值(pg/ml)为12.33%。同一份标本同时作10个反应孔，得CV值(A)为7.81。

讨论

近年来，寡核苷酸的化学合成和各种修饰技术已在我国普及，因此，我们可以按照被检基因序列，通过电子计算机软件合理设计并合成长度在允许范围之内的各种探针，同时根据需要进行修饰或标记。本系统与bDNA技术有相似之处，但最重要的改进是创建了一种更为简便的信号放大探针制备技术^［5～7］。另外，我们在捕获探针的“包被”方式上亦有改进。我们使用的Corning Costar公司生产的脱氧核糖核酸孔表面带有能与氨基化学结合的NOS基团。因此，在一端(5′端或3′端)经氨基修饰的捕获探针可以被牢固地固定在反应板表面。还有，bDNA技术在酶标探针杂交之后，引入了化学发光系统^［8］，我们采用的是酶联杂交系统，操作简单，节约时间，不需特殊仪器设备(见图2)。

Pa:捕获探针；Pb：第一组夹心探针，共10套；Pc：第二组夹心探针，共15套；Pd：生物素标记的信号放大探针；b：生物素图2微孔酶联夹心杂交检测示意图

我们建立的定量检测系统，在某些技术方面与国外类似方法有较大改进，但许多环节仍需进一步修正。以下几个方面值得探讨。

一、灵敏度、特异性及其影响因素

影响寡核苷酸探针杂交技术灵敏度的因素很多，主要有：第一，探针数量和结构。在一定范围内，探针套数的多少与灵敏度呈正比，故应保证足够探针数。但若探针数过多，不仅成本提高，且影响杂交速率，延长杂交时间。较短的探针，杂交速率较快，但稳定性下降；较长的探针，稳定性提高，但若合成质量不高，反而影响杂交效果，且费用提高。各套探针的Tm值应相同或相近，以保证在同一温度下达到最大杂交。我们采用了两组25套夹心探针，均经过严格设计和筛选。其中第二夹心探针仅15套；另外，每套探针的特异互补部分仅20nt，可能影响杂交分子的稳定性，是本系统灵敏度偏低的重要原因。第二，探针质量。如果合成探针中存在较多短片段，势必由于Tm值的不同而影响杂交效果，同时为提高灵敏度而加大探针工作浓度，也将增加非特异结合。本系统中所用夹心探针最佳浓度偏高可能与探针质量有关，有必要提高合成探针的质量。第三，信号放大强度。我们制备的标记信号放大探针5′端的20nt是单链结构，与检测探针(Pc15)3′端互补，双链部分含生物素。由于掺入生物素分子的数量与双链脱氧核糖核酸位碱基数之间有相对固定的关系，因此，只要延长双链D脱氧核糖核酸可能增加