中华传染病杂志2000年第18卷第1期

乐美兆鞠九龙杨志国许家璋宋小明

关键词：庚型病毒性肝炎；动物模型；恒河猴

庚型肝炎由单股正链RNA病毒引起，是一种新型病毒性肝炎^［1-3］。19 96年我们曾对8例单纯庚型肝炎病毒(HGV)感染患者进行过临床病理分析，并作了报道^［4，5］。为了进一步探索庚型肝炎的发生，发展规律，我们建立了恒河猴庚型肝炎动物模型，并对它的血清学及肝脏组织学改变进行动态观察，现将观察结果报告如下。

材料与方法

一、研究动物

选用中国云南健康恒河猴，雌雄各1只，年龄2～2.5岁，体重2～3 kg，动物购于中国科学院动物研究所，经血清病原学检测，甲，乙，丙，戊，庚肝炎病毒指标均阴性。

二、血清学检测

实验前和实验后的恒河猴血清以及HGV阳性患者的血清均进行病原学检测，HGV rNA检测采用 逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法，引物由军事医学科学院合成，取自HGV rNA 5′非编码 区 ，，扩增片段约230 bp，乙型肝炎病毒(HBV) dNA(PCR法)，丙型肝炎病毒(HCV) RNA(RT-PC R法)试剂购于上海华美生物有限公司。抗-甲型肝炎病毒(HAV)-IgM，乙型肝炎病毒标志(H bVM)，抗-丙型肝炎病毒(HCV)-IgG及抗-戊型肝炎病毒(HEV)-IgG检测均采用酶联免疫吸附试验，试剂购于南京军区医学研究所及上海华美生物有限公司。

三、HGV血清来源

采集1例临床病理及血清学检测确诊为单纯HGV感染的慢性庚型肝炎患者血清50 ml，其血清 HGV RNA持续阳性一年，而甲、乙、丙、戊病毒学指标均为阴性。

四、感染动物方法

用氯胺酮1 mg/kg注射麻醉动物后，用HGV RNA阳性血清3 ml静脉注射，每15 d 1次，共3次 。 分别在注射后2、4、9、17周行肝穿活检，作光镜和电镜检查，同时采血作血清学检测。

五、样品处理

肝活检标本分作2份，1份用10%福尔马林固定，作石蜡切片，用作光镜观察及免疫组化染色，1份用4%戊二醛固定，用作电镜观察，1%四氧化锇-亚铁氰化钾(最终浓度)作后固定，梯度酒精脱水，Epon-812包埋，LKB-V型超薄切片机切出薄片，醋酸铀，柠檬酸铅染色，H-300型透射电镜观察。

六、免疫组织化学(免疫组化)及单克隆抗体来源

免疫组化染色采用BA法^［5］，抗庚型肝炎病毒单克隆抗体为HGV-NS5区蛋白鼠单克隆 抗体，由解放军军事医学科学院第五研究所制备提供^［7］，其琼脂双扩散效价为1∶50，生物素标记羊抗鼠IgG为1∶80，辣根过氧化物酶标记亲和素为1∶160，正常鼠血清为1∶50。

结果

一、血清学变化

注射前雄性恒河猴血清丙氨酸转氨酶(ALT)和天门冬氨酸转氨酶(AST)分别为13 u/L，8.0 U/ L，注射后30 d，分别升高到31 U/L (2.4倍)，53 U/L(6.6倍)；雌性恒河猴血清ALT和AST注射前分别为17 u/L和16 U/L，注射后 30 d分别升高到70 U/L(4倍)和90 U/L(5.4倍)。注射后30和90 d雄性猴血清HGV RNA均 呈弱阳性，雌性猴为阴性。

二、肝脏组织学变化

注射HGV阳性血清前肝穿组织光镜观察：肝小叶结构正常，肝细胞索排列整齐，肝细胞界板完整，未见肝细胞有点灶状坏死及淋巴细胞浸润。汇管区无明显炎细胞浸润及纤维组织增生。注射后2周，肝细胞显浊肿，胞质呈颗粒状，其它病变未见。注射后4周肝组织学改变与2周相似，注射后9周，肝细胞出现轻度点状坏死及灶性淋巴细胞浸润。汇管区有轻度碎屑样坏死。注射后17周，肝细胞点状坏死更为明显，肝细胞出现空泡化。电镜观察：注射后2周及4周，肝细胞主要改变是线粒体肿胀，嵴不清，肝糖原增多，胶原纤维无明显增生。注射后9周，肝细胞除上述改变外，部分肝细胞核出现深浅不一的切迹，异染色质增多，呈块状，少数核呈固缩状，粗面内质网扩张，狄氏间隙中胶原纤维增生，有的伸入到肝细胞之间或病变的肝细胞胞质中。肝细胞间有少量淋巴细胞浸润，有些淋巴细胞侵入病变的肝细胞质内。2只实验动物肝组织学改变基本一致。

三、 免疫组织化学染色

在注射HGV阳性血清前，2只恒河猴肝穿组织经免疫组化染色均呈阴性。注射后2周 ，免疫组化染色均显示阴性。注射后4周肝穿组织免疫组化染色均显示阳性，定位于肝细胞浆内，呈黄色或棕黄色颗粒，阳性细胞数量少，而且分散。注射后17周，雄猴呈阳性，雌猴则为阴性。

讨论

1996年我们成功地从1例输血后慢性丙型肝炎患者血清中克隆出HGV部分基因，并作了序列分析，与HGV美国株HGV44402，HGV45966，HGV36380和HGV河北株对应位置的核苷酸同源性分别为89.09%、92.12%、87.27%和93.94%，证实南京地区有庚型肝炎病例^［8］。同时我 们对8例单纯HGV感染者进行临床病理分析，发现单纯HGV感染者多隐匿发病，症状轻，无黄疸，ALT轻度升高，肝细胞损伤轻，胶原纤维增生较早。

HGV动物模型的建立，为研究HGV感染的肝脏组织学动态变化以及庚型肝炎的发生、发展规律提供了一定基础。研究结果显示，注射HGV阳性血清后30 d可以引起恒河猴血清ALT、AST轻度升高，且持续异常。而此时组织学改变仅表现在肝细胞肿胀、胞质内线粒体嵴不清，肝糖原增多，胶原纤维无明显增生。到注射后第9周时，肝细胞出现轻度点状坏死及灶性淋巴细胞浸润。汇管区有轻度碎屑样坏死，未见明显纤维组织增生。电镜下，部分肝细胞核出现深浅不一的切迹，异染色质增多，甚至呈固缩状，粗面内质网扩张。狄氏间隙中胶原纤维增生，并伸入到肝细胞之间及病变的肝细胞质中。由此可见，肝细胞的损伤并不严重，而纤维化进展较早，虽然光镜下见不到汇管区扩大及明显纤维组织增生，但电镜下即可见到较多胶原纤维增生，这对患者的预后将有不良的影响。免疫组化染色表明，阳性颗粒定位于肝细胞浆中，阳性细胞少且分散。动物实验结果与我们以前对8例单纯HGV感染患者的血清学检查及临床病理分析非常一致。由此可说明以下几个问题：(1) HGV可以单独感染人和某些动物；(2) hGV感染后症状轻、肝细胞损伤轻；(3)胶原纤维增生较早。关于2只恒河猴血清HGV RNA检 测结果显示1只为阳性，1只为阴性，阴性者如何解释，我们认为可能与其血清中HGV量有关，因为肝组织免疫组化染色显示阳性。

作者单位：乐美兆（210002南京，解放军第八一医院)

鞠九龙（210002南京，解放军第八一医院)

杨志国（210002南京，解放军第八一医院)

许家璋（210002南京，解放军第八一医院)

宋小明（210002南京，解放军第八一医院）

参考文献

1，Simmons JN, Pilot-Matiast TJ, Leary TJ, et al. identification of fla vivirus genomes in the GB hepatitis agent, Proc Natl Acad sci USA, 1995, 92:3401 -3405.

2，Linnen J, Wages J, Zhang-Keck ZY, et al. Molecular cloning and disease assoc iation of hepatitis G virus: a transfusion-transmissible agent. Science, 1996,271:505-508.

3，周乙华.庚型肝炎研究进展.国外医学内科学分册.1997，24：415-418.

4，乐美兆，苏长青，宋小明，等.庚型病毒性肝炎肝的超微结构观察.武汉大学学报(自然科学版)，1997，电子显微学专刊(Suppl.2)119-120.

5，许家璋，王晓英，隋云华，等.17例庚型肝炎临床病理分析.实用肝脏病杂志，1997，2：27-29.

6，徐在海，初连瑞，孔祥英，等.ABC和BA法的敏感性及其在病毒抗原定位中的应用.中国免疫学杂志，1986，4：241-243.

7，陈万荣，周育森，徐静，等.庚型肝炎病毒NS5区蛋白鼠单克隆抗体的制备.中国病毒学，1998，13：179-181.

8，徐俊杰，周育森，许家璋，等.中国南京庚型肝炎病毒部分基因克隆及cDNA病例分析.中华实验和临床病毒学杂志，1997，11：27-28.