中华皮肤科杂志2000年第33卷第5期

章强强苏逸丹李莉王家俊

摘要目的评价临床致病性酵母对抗真菌药物敏感性及耐药性。方法根据美国国家临床实验室标准化委员会M27－A微量稀释法对临床致病性酵母作了氟康唑、二性霉素B、5－氟胞嘧啶、伊曲康唑及酮康唑5种抗真菌药物敏感性测定。结果65株念珠菌属的MIC范围为：氟康唑0.125～64μg／mL，95.38％(62／65）敏感,2株耐药，占3.08％；伊曲康唑0.03～2μg／mL,63.08％（41／65）敏感，3株耐药，占4.62％；5－氟胞嘧啶0.125～32μg／mL,93.84％（61／65）敏感，2株耐药，占3.08％;二性霉素B0.06～2μg／mL,96.92％(63/65)敏感，2株耐药，占3.08％;酮康唑0.03～0.5μg／mL，全部敏感（65/65）。35株新生隐球菌临床分离株对5种抗真菌药物的MIC范围分别为：氟康唑2～64μg／mL，伊曲康唑0.25～1μg／mL，5－氟胞嘧啶0.25～64μg／mL，二性霉素B0.03～1μg／mL,酮康唑0.125～1μg／mL。结论美国国家临床实验室标准化委员会M27－A微量稀释法具有操作简便，实用性强，结果稳定，重复性好的优点。临床致病性酵母及其不同的菌株对5种常用抗真菌药物的敏感性存在差异。

关键词：念珠菌属；新型隐球菌；微生物敏感性试验

近年来由于深部真菌感染的逐渐增多，耐药菌株的出现及各种抗真菌药物的相继问世，正确合理地选择抗真菌药物及对抗真菌药物敏感性的评价已成为一个突出而且亟待解决的问题^[1]。我们根据美国国家临床实验室标准化委员会（NCCLS）制定的《酵母菌液基稀释法抗真菌药物敏感性试验参考方案》（NCCLSM27－A）^[2],采用微量稀释法技术对临床分离的65株念珠菌属和35株新型隐球菌作了氟康唑、两性霉素B、5－氟胞嘧啶、伊曲康唑及酮康唑5种抗真菌药物的敏感性测定，为建立统一的标准化抗真菌药物敏感试验方法、耐药性标准的确立提供参考依据。

材料与方法

一、材料

1．抗真菌药：氟康唑由上海三维制药有限公司提供,批号：971208，含量99.7％；两性霉素B由上海先锋药业公司提供,批号：971021，含量99.8％；5－氟胞嘧啶由中国药科大学制药股份有限公司提供，含量99.8％；伊曲康唑和酮康唑参考标准品（纯粉）均由墨尔本阿尔弗来德（Alfred）医院真菌室提供。

2．试验菌株：65株念珠菌属分别来自临床送检的痰、尿、粪等标本，选取直接镜检和培养均阳性的菌株，按常规方法、芽管试验和API20CAUX鉴定，其中包括白念珠菌47株，非白念珠菌（热带念珠菌、近平滑念珠菌、平滑念珠菌、季也蒙念珠菌）18株。35株新生隐球菌均来自临床送检的脑脊液标本，经墨汁涂片直接镜检、咖啡酸试验、尿素酶试验及37°C生长鉴定证实。

3.参考菌株：3株白念珠菌参考菌株ATCC76615:09、ATCC76615:108、ATCC76615:19和4株新生隐球菌标准菌株:ATCC32609、BLS109、CBC6901、CDC3502由第二军医大学长征医院皮肤科惠赠，其中已知ATCC76615：09对氟康唑敏感，ATCC76615：108对氟康唑中度敏感，ATCC76615:19对氟康唑耐药。

4.培养基：①RPMI1640液体培养基：RPMI1640粉（含谷氨酰胺，不含碳酸氢钠，美国LifetechnologiesInc）10.4g，三氮吗啡琳丙磺酸（MOPS，Fluka进口分装）34.53g，蒸馏水900mL，NaOH调节pH至7.0，定容至1000mL，用直径0.2μm的无菌针头滤器（GelmanScience）滤过除菌，置4℃冰箱备用。②改良沙堡琼脂：葡萄糖40.0g，蛋白胨10.0g，琼脂20.0g，蒸馏水1000mL，氯霉素0.05mg／mL，高压灭菌。

二、方法

参照NCCLSM27－A推荐的酵母菌微量稀释法药敏试验进行。

1．微量药敏板制备：将配制好的抗真菌药物贮存液用RPMI1640液体培养基做稀释液进行10级倍比稀释，使氟康唑和5－氟胞嘧啶的起始质量浓度为128μg／mL，终末质量浓度为0.25μg／mL，两性霉素B、伊曲康唑和酮康唑的起始质量浓度为32μg/mL,终未质量浓度为0.06μg/mL，以上各药质量浓度均为2倍应测试药物质量浓度。用二甲基亚砜(DMSO)制备的抗真菌药储存液经RPMI1640稀释后DMSO终体积分数不超过1％，经对照试验此体积分数不抑制酵母菌的生长。将稀释好的药液对应加在无菌96孔U形底微量培养板的孔洞中，从第1孔至第10孔洞浓度由高到低，每孔100μL。第11、12孔加不含药液的RP

MI1640液体培养基，其中第11孔为生长对照，第12孔为空白对照。加毕药敏板用铝箔纸密封后放置－80℃保藏备用。

2．菌液制备及接种：将受试菌在沙堡琼脂培养基上连续转种2次，以保证其纯度和活力。取经35℃培养24h（念珠菌）或48h（隐球菌）的菌落，用无菌生理盐水制成菌悬液，并调整其浊度达到在分光光度计530nm波长处测定0．5麦氏比浊管标准产生的透光度，经血细胞计数板计数菌含量为(1～5)×106菌细胞／mL;用RPMI1640液体培养基1∶50稀释后再1∶20稀释（共稀释1000倍）至菌含量为(1～5)×103菌细胞/mL（2倍菌接种液浓度）。将冷冻药敏板按－20℃、4℃、室温各1h的融化程序融化后置超净工作台上，用微量移液器以从第11孔至第1孔的顺序每孔加100μL菌悬液（此时各孔药液和菌悬液均分别达到应测试的浓度），第12孔不加。

3．培养及结果判定：接种后的药敏板置35℃湿盒孵育，分别于培养24、48、72h观察受试菌生长情况，念珠菌于48h、隐球菌于72h读取结果。视觉法判定终点^[3,4]：96孔培养板各孔充分混匀后与生长对照孔比较，生长完全抑制，培养基清亮所对应的最低药物浓度为两性霉素B的最低抑菌浓度（MIC）；5－氟胞嘧啶及唑类药物则以≥80％生长抑制（IC80，40μL生长对照稀释至160μL培养基中，产生的浊度）所对应的最低药物浓度为其MIC。

结果

一、参考菌株对抗真菌药物的敏感性

7株参考菌株均重复3次进行氟康唑、两性霉素B、伊曲康唑、5－氟胞嘧啶、酮康唑的药敏测定，结果显示MIC的范围不超过1个药物浓度梯度。新生隐球菌MIC，氟康唑为1～16μg/mL,5－氟胞嘧啶为0.5～8μg/mL,两性霉素B为0.125～0.5μg/mL,伊曲康唑为0.125～0.5μg/mL,酮康唑为0.06～0.5μg/mL;白念珠菌MIC，氟康唑为0.5～8μg/mL、1株为64μg/mL，5－氟胞嘧啶为2～4μg/mL、1株为64μg/mL念珠菌属；新型隐球菌；微生物敏感性试验，两性霉素B为0.125～2μg/mL,伊曲康唑为0.125～2μg/mL,酮康唑为0.03～0.5μg/mL。

二、临床分离菌株对抗真菌药物的敏感性

35株新生隐球菌、47株白念珠菌及18株念珠菌属重复3次测试5种药物的MICs,MIC波动范围不超过一个药物质量浓度梯度。培养24h观察结果。各菌株的药敏结果以3次测试中出现次数最多的MICs作为该菌的MIC。唑类药物在较宽的质量浓度范围内产生部分抑菌，多数有拖尾现象，因而对终点判读造成一定困难。本实验发现于24h判读结果较48h判读相对清晰些，所得MIC值一般只相差一个质量浓度梯度或不变。结果见表1、2。

讨论

我们用标准微量稀释法对7株标准菌株的氟康唑、两性霉素B、伊曲康唑、5－氟胞嘧啶和酮康唑3次重复药敏测定结果显示，MIC波动范围不超过一个药物质量浓度梯度，且从已知氟康唑分别为耐药、中度敏感和敏感的3株标准菌株的重复测定结果显示均在NCCLSM27－A中公布的氟康唑对念珠菌感染的药敏分界点标准范围内，证实了NCCLSM27－A方案的可重复性和结果的一致性。

酵母菌的标准液基稀释法药敏试验的研究进展使药敏结果（MIC）与临床治疗效果之间建立了一定的相关性，在某些情况下，尤其是在HIV感染患者和用氟康唑治疗的复发性口腔念珠菌病患者，通过对念珠菌属的体外药敏测定已能预测临床治疗效果。我们对65株念珠菌属的药敏结果显示，5种药物的MIC范围分别为：氟康唑0.125～64μg／mL；伊曲康唑0.03～2μg／mL；5－氟胞嘧啶0.125～32μg／mL;两性霉素B0.06～2μg／mL;酮康唑0.03～0.5μg／mL。对于药敏结果的临床意义，也即相关性问题尚需结合临床进一步研究，以确定适合我国的念珠菌属药敏分界点标准。35株新生隐球菌临床分离株对5种抗真菌药物的MIC范围分别为：氟康唑2～64μg／mL，伊曲康唑0.25～1μg／mL，5－氟胞嘧啶0.25～64μg／mL，两性霉素B0.03～1μg／mL,酮康唑0.125～1μg／mL。伊曲康唑的MIC范围较窄，仅3个质量浓度梯度。因目前尚未建立新生隐球菌的药敏分界点标准，暂以念珠菌的药敏分界点为参考。受试隐球菌中有1株氟康唑的MIC≥64μg／mL，临床资料显示该菌为一隐球菌性脑膜炎患者于第1次脑脊液培养分离出新生隐球菌后，经氟康唑治疗1个月，于复查脑脊液时第2次培养分离获得的；而第1次分离株氟康唑的MIC为16μg／mL，前后2次分离株两性霉素B的MIC分别为0.25μg／mL和0.5μg／mL，该患者改用两性霉素B治疗后痊愈，复查脑脊液直接镜检及培养均阴性。此外，从另2例隐球菌性脑膜炎患者脑脊液中分离出的新生隐球菌对两性霉素B的敏感性（MIC）均为0.03μg／mL,而这2例患者应用两性霉素B分别治疗3个月和4个月，两性霉素B总量超过3g和4g，症状明显好转，真菌培养转阴。由此推测，在隐球菌性脑膜炎患者中新生隐球菌氟康唑药敏结果与临床治疗效果间有一定的相关性，而两性霉素B药敏结果与临床效果间相关性不明显。

表1临床分离菌株药敏测定的MIC分布情况