中华肝脏病杂志2000年第8卷第2期

田琦琦郭素萍谭复明李明山李江王志明

摘要目的 了解HBV前Ｃ区Ａ83 变异与重型肝炎的关系。方法 用套式错配 PCR限制片段长度多态性分析和凝胶光密度图象分析仪及定量PCR，对９例重型肝炎患者血清 hBV 变异株的比率和 HBV DNA 含量进行测定和动态观察。结果A83变异株在６例阳性者中均与野生株呈混合感染，其比率＞50.0%的仅２例，存活死亡各１例；＜31.0%的４例均死亡。变异株的出现及其比率变化与 hBV DNA 含量的消长一致，但无统计学相关性（r 分别为0.60和0.58; p 值均＞0.05)。结论该变异株单独引发重型肝炎的可能性极微，它在重型肝炎中的出现可能只是高度免疫压力下病毒复制过程中的伴随现象。

关键词：肝炎病毒，乙型；变异,前Ｃ区；比率；重型肝炎

HBV前Ｃ区 A83变异株在重型肝炎中有较高的检出率，且病死率高于非变异株感染者[1]。现对９例 hBV 相关的急性和亚急性重型肝炎患者作 A83 变异株比率及 HBV dNA含量的平行测定，对其中２例系列血清进行动态观察，结果如下。

资料与方法

一、病例及血清

９例重型肝炎患者均为我院住院者，男５例，女４例，年龄９～45岁。根据 1995年北京病毒性肝炎会议修订标准，急性重型肝炎４例，（经病理证实１例）；亚急性重型肝炎５例。共死亡７例，存活２例。

９例患者血清均于入院次日留取，其中２例为间隔 2～3周留取的系列血清。所有血清标本 HBsAg均为阳性，丙型肝炎、戊型肝炎及丁型肝炎血清病毒学指标均为阴性；2例存活病例首份血清同时检出HAV抗体。血清留取后置-30℃冻存，统一检测 a83 变异株比率以及 HBV DNA 含量。

二、方法

1. A83 变异株比率的测定：应用套式错配 PCR限制片段长度多态性分析（mpPCR-RFLP）[2]和凝胶光密度图象分析仪进行测定。对待检血清进行HBV dNA的抽提、套式PCR扩增、酶切及电泳，在紫外透射仪中观察有无分别代表野生株（102 bp）和变异株（81bp）的特异荧光带，判断单独野生株感染、单独变异株感染或为二者混合感染。根据混合感染中两条光带的强弱区分变异株的优势、均势或弱势感染。用美国冷泉港公司的Eagle eye凝胶图象分析系统测定两条特异荧光带的密度值,并用以下公式计算出A83变异株比率测定值：

再将测定值代入源自变异株比率标准品的直线回归方程，得出待检样品的变异株比率。

套式mpPCR引物由上海生工生物工程公司合成，其余PCR试剂购自华美生物工程公司。内切酶 bsu36Ⅰ购自美国Promega公司。

2.A83变异株比率标准品的制备：将一份已知为完全变异株感染血清样品的mpPCR产物等分为两份，分别装入Ａ管和Ｂ管，并加入等量酶切缓冲液。Ａ管加内切酶，Ｂ管不加酶而以蒸馏水替之。两份样品共同经过37℃水浴12h后，Ａ管样品经酶切只有81 bp片段，而Ｂ管样品仍保留原有的102bp片段。将两管样品按变异株比例标准值配制成10%、30%、50%、70%及90%的标准品后，分别与2.5倍体积的无水冷乙醇混匀置-20℃过夜，再离心、重悬，与待检样品同胶电泳。用凝胶光密度图象分析仪测定出各标准102 bp和81 bp两条荧光带密度值，计算出变异株比率测定值，并与标准值比较建立直线回归方程。

3. HBV DNA 定量分析：用美国AG-9600型定量PCR扩增仪及其配套试剂盒测定血清HBV dNA含量。HBV DNA含量以＞1×107 拷贝/L为阳性，用常用对数值表达。

结 果

９例重型肝炎患者中６例检出 A83变异株（１例在入院后两周检出），均为混合感染。２例变异株优势感染者为亚急性重型肝炎，变异株比率分别为64.8%和59.3%，存活、死亡各１例；２例亚急性重型肝炎和２例急性重型肝炎均为弱势感染，变异株比率分别30.6%、24.6%、14.8%和 4.7%，均死亡。另有３例为单独野生株感染，存活１例，死亡２例。其中２例系列血清的检测显示，该变异株的出现、消失及其比率的动态变化与血清病毒总量的消长是一致的（图１），但无统计学相关性（r=0.60和 r=0.58; P ＞0.05)。

图12例系列血清A83变异株比率和HBV dNA含量的动态变化

讨 论

重型肝炎中 A83 变异株的检出率较高（6/9），病死率高达83.3%。3例为单独野生株感染，无１例是单独变异株感染。变异株均与野生株呈混合感染，且在大多数死亡病例中，尤其是急性重型肝炎血清病毒总量中所占的比率是很低的。该变异株的有无及其比率的高低与临床及预后均未显示相对固定的关系。A83变异株并非影响重型肝炎临床及预后的主要毒株和直接因素。

A83 变异株在慢性 HBV感染中广泛存在，而在急性肝炎中极少检出[3]。急性重型肝炎和亚急性重型肝炎何以有相对较高的检出率？系感染初始即已存在，或为感染后才发生尚不清楚。本组２例患者初始感染为野生株，随病毒水平升高出现的少量变异株，又随病毒清除而消失。当病毒复制再次活跃时，变异株以相对较高的比例再度出现（例2）；变异株比例的升降与 hBV DNA 水平的消长是一致的（例 1）。表明变异发生于免疫攻击之下的病毒复制过程中,与机体对病毒的免疫清除及 HBV 的再燃有关;是病毒逃逸免疫清除、减缓免疫压力的生存策略。同时由于发生变异的毒株并不能完全地逃避免疫清除，成为稳定的感染优势株可能需要一个较长的积累过程，而重型肝炎病程较短，因而变异株比率多较低，慢性活动性 hBV感染则相反。本组仅有的２例变异株优势感染者，虽然临床诊断为亚急性重型肝炎,但均未作肝活检，故不能完全排除在原有慢性或隐匿性 hBV 感染基础上的急性发病。A83变异株在重型肝炎中是否以高检出率、低比率为其特点，有待于更多的临床及病理资料证实。

田琦琦，女，47岁，副主任医师从事病毒性肝炎诊治和临床研究，发表论文10篇，获军队科技进步和医疗成果奖4项

田琦琦（050041石家庄，解放军第260医院传染科)

郭素萍（050041 石家庄，解放军第260医院传染科)

谭复明（050041 石家庄，解放军第260医院传染科)

李明山（050041 石家庄，解放军第260医院传染科)

李江（050041 石家庄，解放军第260医院传染科)

王志明（050041 石家庄，解放军第260医院传染科）

参考文献

［1］刘华瑞,王小飞,王锦蓉,等.乙型肝炎病毒基因前C区突变株感染的检测及临床意义.中华肝脏病杂志, 1994, 2: 138-140.

［2］骆抗先,杨洁,李秀惠, 等. 前C区A83点突变在乙型肝炎病毒感染中的分布.中华医学杂志, 1994, 74: 478-480.

［3］田琦琦，郭素萍，王志明，等.乙型肝炎病毒前C区A83变异株的临床检测及分析.肝脏，1999, 4: 6-7.