第四军医大学学报2000年第21卷第4期

叶苓廖文俊刘彦仿杨守京

摘要:目的研究汉坦病毒(HTV)感染后对细胞应激基因表达的影响.方法用HTV感染其敏感细胞 株VeroE6细胞，用Western印迹杂交、RNA斑点杂交及原位杂交分别分析热休克蛋白(HSP)的表达及 编码HSP的mRNA水平的变化.结果病毒感染后细胞内HSP70及热休克蛋白mRNA水平均有增高 ，而HSP65及HSP27的表达则无明显改变.结论HTV感染可以直接诱导HSP70的高表达，可能在保护细胞免受病毒感染损伤方面具有一定意义.

关键词:热休克蛋白；汉坦病毒；VeroE6细胞

0引言

应激反应是广泛存在于包括原核至真核生物界的一种对外界有害刺激的保护性反应，以表达热休克蛋白（heart shock proteins,HSP）为特征^［1］.已有一些体外实 验证实，细胞在受到某些病毒感染后可以诱导HSP的产生，但对汉坦病毒（Hantaan virus,HTV）感染与HS P表达间 关系尚未见报道. 我们用A9株感染病毒敏感细胞株VeroE6细胞，观察并检测了病毒感染后细胞内HSP表达和HSP70 mRNA水平的改变情况，以期了解HTV感染对细胞的影响及细胞对HTV感染的应激反应.

1材料和方法

1.1材料非洲绿猴肾上皮细胞（VeroE6细胞）和抗HTV nP组特异性mAb (中国预防医学科 学院病毒所，本室保存)；HTV a9株乳鼠脑悬液(中国预防医学科学院病毒所馈赠). 鼠 抗 人HSP70 mAb,鼠抗人HSP65 mAb、山羊抗人HSP27多克隆抗体（美国Santa Cruz公司），H RP-驴抗山羊IgG,HRP-羊抗鼠 IgG（武汉博士德生物制品公司）.同位素［α³²P］ -dATP（北京亚辉生物医学工程公司），核酸标记及检测试剂盒（德国Boehringer mannhei m公司）.

1.2 方法VeroE6细胞在含50 mL·L^-1胎牛血清的RPMI1640培养基中培 养，将细胞分为2组，第1组为病毒感染组，待细胞至60%融合时，倒掉大部分培养液，接种汉坦病毒A9株100 μL，置37℃病毒吸附1 h后换新鲜培养液，分别于感染后4，8，24，72 h 及5 d时收集被感染细胞，提取细胞内RNA和蛋白质,于同样时间收取少量细胞涂片做原位杂 交检测. 第2组为模拟感染组，与感染组同时倒掉大部分培养液但不加入病毒，1 h后换培养 液,与感染组同样时间段收取细胞做相应检测. 用DNA合成仪合成HSP70相应的寡核苷酸探针，用［α³²P］-dATP5′-末端标记法制备探针，以进行RNA斑点杂交. ①RNA斑点杂交:用异硫氰酸胍一步法提取细胞总RNA，将20 μg总RNA点于尼龙膜上，置于真空干燥箱中80℃烤膜2 h ，2×SSPE洗 膜，42℃预杂交2 h，加入［α³²P］-HSP70寡核苷酸探针42℃杂交过夜，次日用2× sSPE洗膜数次，放射自显影. ②Western印迹杂交:收集不同时间点的感染组及模拟感染组VeroE6细胞的细胞内总蛋白， -20℃保存待用. 取等量的两组待测蛋白进行120 g·L^-1 sDS-PAGE电泳，用Bio -Rad微型电转移系统将蛋白质转印至硝酸纤维素膜上进行Western印迹杂交分析.③原位杂交: 质粒PHHSP70和pGs分别含HSP72基因cDNA片段及汉坦病毒S片段,分别经适当酶切,冻溶 法回收特异性片段，加热变性后用异羟基洋地黄毒苷配基-11-dUTP(Digoxigen-11-dUTP ）随 机引物延伸法标记制备探针. 细胞铺片，40 g·L^-1多聚甲醛后固定，逐级乙醇脱水，加探针42℃杂交12 h， SSC振洗，逐级乙醇脱水，加碱性磷酸酶标记的抗Dig抗体检测，N bT/BCIP呈色.

2结果

2.1汉坦病毒感染后HSP70蛋白表达未感染组在27,65,70 ku均可见到一 条着色带，但颜色较浅；病毒感染后4 h组在70 ku的染色带颜色加深，提示HSP70表达增强，这种高 表达持续至感染后3～4 d，以后HSP70表达恢复至正常(Fig1). HSP65和HSP27则无明显变化 . 汉坦病毒NP蛋白的表达于感染后3 d可被检出，表现为在47 ku处出现一条着色带，第 5日组着色带明显加深(Fig 2).

图 1汉坦病毒感染后不同时间HSP70免疫印迹杂交

fig 1HSP70 Western blot after different periods of Hantaan virus infectio n

a:4 h; B:8 h; C:24 h; D:3 d; E:5 d; F:mock infection; G: normal control.

2.2汉坦病毒感染诱导HSP70 mRNA表达病毒感 染后4 h时HSP70 mRNA即增高，且持续至感染后3 d，以后HSP70 mRNA水平逐渐恢复至正常水 平（Fig 3）.

2．3原位杂交感染后4 h组即可见细胞内HSP70 mRNA水平增高，表现为细胞质 内紫蓝色阳性杂 交信号，8 h组结果与4 h组一致（Fig 4)，以后各组阳性信号逐渐减弱至正常水平.而模拟 感染组个别细胞内可见较弱的紫蓝色阳性杂交信号.

图 2汉坦病毒感染后不同时间病毒核蛋白免疫印迹杂交

fig 2VNP Western blot after different periods of Hantaan virus infection[ HT6]A:Normal control; B: 4 h; C:24 h; D:3 d; E:4 d; F:5 d.

图 3汉坦病毒感染后HSP70 mRNA斑点杂交

fig 3HSP70 mRNA dot blot after virus infection

n:normal control; M:mock infection.

图 4汉坦病毒感染后8 h veroE6细胞HSP70mRNA原位杂交示细胞内紫蓝色阳性颗粒

fig 4HSP70 mRNA in situ hybridization: dark-blue granules in VeroE6 cytoplasm8 h after virus infection×400

3讨论

已有一些体外实验证实，细胞在受到某些病毒（包括DNA和RNA病毒）感染后可以诱导HSP家族不同成员的过度表达^［2，4］，而且不同的病毒感染不同类型的细胞诱导 HSP家族成员的表达也不同（包括被诱导的HSP的类型及数量），说明机体对不同类型病毒感染的反应是特异性的^［5］. 关于HTV感染能否诱导HSP表达，诱导何种HSP表达及其表达与 病毒感染间的关系尚未见报道.我们曾对流行性出血热尸检组织中HSP70的表达进行过检测,发现有HSP70的表达^［6,7］. 但HSP70的表达诱因可能是病毒感染,免疫反应或局部损伤因素所 致. 我们用汉坦病毒A9株在体外感染病毒敏感细胞株VeroE6细胞，目的在于排除了体内炎症、局部损伤和免疫反应等的影响（因为这些因素也可诱导HSP的产生），独立地观察病毒感染本身是否也能直接诱导了HSP的合成.用免疫印迹杂交法检测了病毒感染后不同时间点收集的细胞内总蛋白中HSP70,HSP65,HSP27和HTV NP蛋白的表达情况，结果发现在感染后4～8 h即可见HSP70的表达量增加，24～72 h HSP70表达量最高，以后恢复至正常.提示汉坦 病 毒感染可以诱导HSP70的表达，而HSP27和HSP65则未见明显改变.在本实验中，于不同时间 点分别提取细胞内总RNA进行RNA斑点杂交及不同时间点的细胞铺片进行的原位杂交，结果观察到病毒感染后细胞内HSP70 mRNA水平的增高，提示汉坦病毒感染诱导的HSP70表达的增高是在转录水平的调节.

关于病毒感染后HSP出现的意义目前尚无定论，一般认为HSP可能干扰了病毒蛋白的产 生和装配^［8，9］，从而保护细胞免受病毒感染的损伤.也有报道认为HSP参与病毒 的复制、 整合^［10］.有关汉坦病毒诱导细胞表达HSP70的确切意义，将在进一步的实验中予以证实.

基金项目:国家自然科学基金资助项目(39770664)

作者简介:叶苓(1963-),女(汉族),山西省长治市人.博士,发表论文1 0篇.现工作单位: 广州中山医科大学基础医学院博士后流动站. tel.(020)87330566(O)E mail.yelingy@163.net叶苓（第四军医大学基础部病理学教研室,陕西 西安 710033)

廖文俊（第四军医大学基础部病理学教研室, 陕西 西安 710033)

刘彦仿（第四军医大学基础部病理学教研室, 陕西 西安 710033)

杨守京（第四军医大学基础部病理学教研室, 陕西 西安 710033）

参考文献:

［1］ Feige u, Polla BS. Heat shock proteins:The HSP70 -a multi-g ene,multi-structure,-function family with potential clinical applications ［J］. Experientia， 1994；50(11-12):979-986.

［2］ Jindal S, Markovsky M. Stress responses to viral infection［J］. trends Microbiol，1994；2(3):89-91.

［3］ Santomenna LD, Colberg-Poley AM. Induction of cel