中国人兽共患病杂志2000年第16卷第3期

尹秋生马立人王北宁

摘要：目的快速全面检测感染人体、动物和细胞培养的多种常见支原体。方法从12种支原体的16S与23SrRNA核酸序列中选择了两段高度保守的核酸序列，作为支原体通用引物，一次PCR扩增就能检测出12种支原体。结果用这对通用引物检测了41份临床标本，16份细胞培养物和20只大白鼠，阳性率分别为14.6%、43.7%和20.0%。结论用通用引物检测支原体具有覆盖面广、检测种数多、不易发生漏检等优点。

关键词：支原体通用引物支原体临床标本细胞培养物

软膜体纲内有4目5科8属，共157个成员，其中能够感染人体引起致病的有12种之多。如溶脲脲原体(U.urealytiem，Uu)。人型支原体(M.hominis，M.h)可感染人类泌尿生殖系统，引起非淋菌性尿道炎，其感染率分别为40%～50%和10%～20%^［1～3］。近年有文献报道，发酵支原体与AIDS的发病有关，是AIDS的协同因子^［4］。除对人体致病外，支原体还常常感染动物和细胞培养物，细胞培养物被支原体污染率在20%～50%之间^［6.7］。动物被支原体感染后，可引起发病，使实验动物不符合科研要求，影响研究结果的准确性与要求。因此，建立一种快速、灵敏、广谱的支原体检验方法是十分必要的。

1材料与方法

1.1菌株与培养实验用支原体菌株有溶脲脲原体，人型支原体，精氨酸支原体，发酵支原体，口腔支原体，唾液支原体，溶神经支原体，肺支原体，莱氏无胆甾支原体，关节炎支原体，猪鼻支原体和猪肺炎支原体，以上菌株分别购于北京三间房生物制品研究所，中国兽药监察所和首都儿童医院研究所，由北京三间房生物制品研究所代为培养。

1.2支原体通用引物的设计我们对T Uemori等^［5］公布的12种支原体部分16S rRNA和23S rRNA核酸序列，以及两种rRNA之间的间隔区核酸序列进行了比较，从中选择了两段高度重复的核酸序列，经PCRDESN分析合格后作为支原体通用引物，引物序列为：5’－TCGTAACAAGGTATCCCTAC－3’和5’－GCAT(T/C) CAC(C/T)AA A(A/T)ACT CT－3’。由军科院二所合成。

1.3标本中DNA的制备

1.3.1临床标本中DNA的制备用1ml培养液洗涤采集于我院妇产科疑为尿道炎病人的阴拭子，取0.2ml接种于溶脲脲原体培养基，37℃培养1～2周作为对照。剩余0.8ml标本离心12 000r/min 20min，弃上清，加50μl STE液，1%NP40，煮沸10min，离心8 000r/min 5min，上清液用于PCR扩增。

1.3.2细胞培养物中DNA的制备细胞培养物以12 000r/min离心20min，倾去培养液，加入0.5ml STE液混悬，加入蛋白酶K至终浓度为100μg/ml，裂解细胞消化蛋白，煮沸10min，离心8 000r/min 5min，上清液用于PCR扩增。

1.3.3动物标本中DNA的制备大白鼠为一级实验动物，由军科院实验动物中心提供。将大鼠杀死，取出气管用无菌生理盐水灌洗，离心12 000r/min 20min，弃上清，加50μl STE液，1%NP40，煮沸10min，离心8 000r/min 5min，上清液用于PCR扩增。

1.4PCR扩增总反应体积为20μl，按常规加入PCR缓冲液，dNTP，Taq酶，引物和样品，扩增条件：预变性94℃2m，94℃30s，50℃30s,72℃60s，循环35次；72℃延伸10min。

2结果

2.1通用引物对支原体标准株的扩增结果用我们设计的通用引物对人型支原体(Hom)、关节炎支原体(M.arthritidis，Art)、唾液支原体(M.salivarium，Sal)、精氨酸支原体(M.arginini，Arg)、口腔支原体(M.orale，Ora)、溶脲脲原体(Uu)、发酵支原体(M.fermentans，Fer)、溶神经支原体(M.neurolyticum，Neu)、猪肺炎支原体(M.hyorhinis，Hyp)、猪鼻支原体(M.hyopneumoniae，Hyo)、肺支原体(M.pulmonis，Pul)和莱氏无胆甾原体(Acboleplasma Laidlacoii，Ala)共12种支原体进行了扩增，在1.5%的琼脂糖凝胶上电泳后均有相应的扩增带出现，扩增片段在261～576bp之间，如图1，(Hyo,Pul结果未显示)。

图1支原体通用引物扩增10种支原体电泳结果

1.PCR marker;2.Hom261bp;3.Arg262bp;4.Sal295bp;5.Art300bp;6.Ora316bp;7.250bp PCR扩增产物；8.Uu300bp;9.Her391bp;10.Neu393bp;11.Ala400bp;12.Pul576bp;

2.2通用引物检测标本结果

2.2.1支原体通用引物检测阴拭子结果我们共检测了41份疑为泌尿生殖道感染的临床标本(阴拭子)，同时培养作为对照。结果41份标本用通用引物扩增后有6份标本为阳性，阳性率为14.6%；培养法有9份标本培养基由黄变为红色，经进一步鉴定，其中有3份是由细菌污染所致，为假阳性。说明培养法容易被细菌污染，干扰培养结果，而PCR法不受细菌污染所干扰，并且灵敏度也不低于培养法。

2.2.2通用引物检测细胞培养物和动物结果检测了16份细胞培养物，HeLa细胞9份，Vero细胞5份和传代细胞2份；大白鼠气管30份。阳性率分别为43.7%和20.0%。

3讨论

我们设计的这对支原体通用引物一次PCR扩增就能同时检测出12种支原体。其中包括感染人体泌尿生殖系统的Uu和Hom；感染细胞培养物的Ora、Hyo、Fer、Arg和Ala五种常见支原体，这五种支原体占细胞感染的95%以上；以及感染大白鼠的Neu、Art和Pul三种常见支原体。与特异性引物相比，用我们设计的通用引物检测临床标本，动物标本或实验标本时，覆盖面大，不易漏检等种特异性引物所不具备的优点，为支原体的检测提供了一种非常具有实用价值的检验方法。

尹秋生（北京军区总医院北京，100700）

马立人（军事医学科学院）

王北宁（北京军区总医院北京，100700）

参考文献

1，Gnarpe H.Friberg J.Mycoplasma and human reproductive failure 〔J〕.Am J Obstet Gynecol,1972,114∶727.

2，朱云霞，吴志君.女性生殖道炎症者CT，UU套式PCR检测分析〔J〕.中国优生与遗传杂志，1996，4(6)∶17.

3，M.Abele-Horm,C.Wolff,P.Dressel,et al.Polymerase chain Reaction versus Culture for Detection of Ureaplasma urealyticum and Mycoplasma hominis in the Urogenital Tract of Adults and the Respiratory Tract of Newborns 〔J〕.Eur J Clin Microbiol Infect Dis,1996,15∶595.

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5，T Uemori,K Asada,Ikunoshin Kato,et al.Amplification of the 16s-23s spacer Region in rRNA Operons of Mycoplasmas by the polymerase chain Reaction 〔J〕.System Appl Microbiol，1992,15(1)∶181.

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