中国人兽共患病杂志2000年第16卷第3期

李少平王红刘维达许振毅牛云彤

摘要：目的建立和评价从血标本中直接PCR检测病原真菌的方法。方法用红、白细胞裂解液，基因释放剂等直接处理血标本，提取微量的靶DNA，然后用真菌通用引物及种特异性引物进行PCR扩增。结果在几种重要致病真菌制备的人血标本中检测出靶DNA，其敏感性达10个孢子／ml以下，且从标本处理到报告结果仅需6h。结论用PCR方法可简便快速特异敏感地从血标本中直接检测病原真菌，提示可为临床快速诊断深部真菌病打下基础。

关键词：致病真菌PCR诊断

最近，我们以PCR技术研究比较了从人血标本中直接快速检测病原真菌的方法和条件，取得满意结果，现报告如下。

1材料与方法

1.1菌种白念珠菌C_1a和C_1d，新生隐球菌C_1nl，烟曲霉A₁、黑曲霉A₃、马内菲青霉B₃₃和B_m，多变毛霉B₃，串珠镰刀菌B₁₉和岛青霉B₂₇共10株标准菌株均由中国微生物菌种保藏管理委员会医学真菌中心提供。使用时转种至新鲜配制的沙氏固体培养基，28℃培养。

1.2重要试剂曲拉通X－100，上海化学试剂站分装。异硫氰酸胍（分子生物学级），Promega公司产品，蛋白酶K，Merck公司产品，基因释放剂（Genereleaser），Bio Ventures公司提供。Lyticase购自Sigma公司。PCR用相关试剂均购自Promega公司。

1.3引物通用引物①UNI－F5＇－GCA TAT CAA GCG GAG GAA AAG－3＇和UNI－R5＇－GGT CCG TGT TTC AAG AAG ACG－3＇^［1］，通用引物②5＇－ATT GGA GGG CAA GTC TGG TG－3＇和5＇－CCG ATC CCT AGT CGG CTA AG－3＇^［2］；3对种特异引物分别为烟曲霉Afl－5＇－GCA TTC GTG CCG GTG TAC TTC－3＇，白念珠菌Cal－5＇－TTG GAG GGG GAT AAT GG－3＇，新生隐球菌Cnl－5＇－AGT TCT GAT CGG TGG ATA AGG GCT－3＇，分别配以第1对通用引物中的UNI－R。

1.4样本制备白念珠菌和新生隐球菌常规培养48h，其它丝状真菌培养5～7天，收获制备孢子悬液。用生理盐水调至浓度约1×10⁷个CFU／ml。取健康人肘静脉血6ml加1.5ml枸椽酸葡萄糖（ACD）抗凝。然后加菌悬液系列稀释，浓度由10⁶～10¹CFU／ml。并分别取100μl混入琼脂平板进行菌落计数以验证浓度和菌的活力。

1.5样本处理取500μl含菌的血标本置无菌的1.5ml EP管中，加1ml红细胞裂解液（10mM Tris（pH7.6），5mM MgCl₂，10mM NaCl），37℃孵育10min后离心（10min，5000×g）。沉淀加500μl白细胞裂解液（10mM Tris（pH7.6），10mM EDTA（pH8.0），50mM NaCl，0.2％SDS，200μg蛋白酶K／ml），65℃水浴2h。5000×g离心15min。以下处理有3种方法，即破壁酶法^［3］，异硫氰胍法^［4］和基因释放剂法^［5］。经反复摸索比较，推荐用改进的基因释放剂法，即上述沉淀加100μl无菌去离子水后混匀，取50μl标本扩增管底部，再加基因释放剂（Bio.ventures公司专利产品，编号：Lot＃2497）50μl，混合后其上加一层石蜡油，在微波炉（广东顺得微波炉制造公司生产，E－100E－2）以5档火力加热7min，处理后取15μl作为反应模板进行PCR扩增。

1.6PCR在50μl反应总体积中，含15μl模板DNA，2U Taq酶，200μM dNTP，2×30pM引物，2mM MgCl₂。反应程序为：首先94℃ 5min初始变性，然后94℃、30sec，60℃、30sec，72℃、60sec，共35个循环。最后72℃延伸5min，取10μl反应产物上样进行琼脂糖凝胶电泳，然后EB染色，透射紫外灯下观察、照像。

另外用种特异引物进行二次套式扩增，并尝试了一管多对引物的多重反应PCR。

2结果

2.1通用引物的通用性验证图1显示用2号通用引物成功扩增出10株受试菌株的靶DNA，大小约485bp，且无非特异性扩增带出现。

2.2PCR实验敏感性的测定用白念珠菌C_1a株、新生隐球菌C_1nl株和烟曲霉A₁株分别进行敏感性测定，引物为2号通用引物，扩增片段大小为485bp左右。结果表明C_1a的敏感性可达10¹个孢子／ml（见图2），C_1nl则为10²个孢子／ml，A₁为10¹个孢子／ml。重复多次均获相同结果。

图1.通用引物的通用性实验（1）泳道1为分子量标准：2－6依次为C_1a，C_1d，C_1nl，B₃₃，B_m和B₃。分子量大小为485bp。（2）泳道1为分子量标准；2－5依次为A₁，A₃，B₁₉和B₂₇，分子量大小亦为485bp左右，泳道6为人血细胞DNA对照。

figure 1.Amplification productions of ten pathogenic fungi using the fungus－specific primer.

（1）.Lanes：1.molecular marker；2－3.Candida albicans C_1a and C_1d；4.

Cryptococcus neoformans C_1nl；5－6.Penicillium marneffei B₃₃ and B_m；7.Rhizomucor variabilis B₃.（2）.Lanes：1.Marker；2.Aspergillus fumigatus A₁；3.A.niger A₃；4.

Fusarium moniliforme B₁₉；5.Penici－llium islandicum B₂₇；6.negative control.

图2.PCR实验敏感性测定

试验菌株为白念珠菌C_1a株，M为分子量标准，扩增带大小约为485bp。泳道8－2为血中菌量浓度变化梯度，由高至低依次为10⁷－10¹ CFU／ml，泳道1为空白对照。

Figure 2.Detection on sensitivity of the PCR test.

The strain tested is C.Albicans（C_1a）.M：marker；Lane 1：negtive control；Lane 2－8：variable gradient of numbers of fungi in blood specimens，from 10¹ to 10⁷ CFU／ml.

2.3种特异引物二次套式扩增与多重PCR图3显示用3对种特异对通用引物的扩增产物进行二次套式扩增的结果。在550～650bp区段的DNA带均为用1号通用引物扩增出的靶DNA带（约620bp），而在156～245bp范围内的DNA带则为不同种特异性引物扩增出的特异性DNA条带，其中泳道9为用引物Ca－1和Cn－1做多重引物PCR从白念珠菌、新生隐球菌和烟曲霉混合产物（用1号通用引物）中成功扩增出白念珠菌和新生隐球菌种特异性条带，前者为156bp，后者为183bp。

图3.二次套式扩增和多重PCR

m为分子量标准，泳道1为C_1a，C_1d和C_1nl混合扩增产物（用1号通用引物），泳道2为C_nl特异引物对泳道1的二次扩增，泳道3，5，7分别为C_1a，C_1nl和A₁通用引物扩增带，而泳道4，6，8则分别为C_a1，C_n1和C_f1种特异引物的二次套式扩增带，大小分别为156，183和192bp，泳道10为C_a1，C_n1和A₁混合通用引物扩增产物，泳道9为用C_a1和C_n1种特异引物进行多重PCR，获得两条特异性扩增带。

figure 3.Second nested－PCR and multiple－PCR.

m：molecular marker；Lane 2：multiple amplification production from C_1a，C_1d and C_1nl using primer 1；Lane 3，5，7，10：amplification bands for C_1a，C_1nl and A₁，respectively；Lane 4，6，8：second amplificiation bands using the species－specific primers for C_a1，C_n1 and C_f1；Lane 9：two specific bands from a multiple＿PCR in a tube with species－specific primers，for C_a1 and C_n1.

3讨论

若要将敏感特异的PCR技术成功用于深部真菌病的早期诊断，必须解决几个关键性的技术问题。一是引物的通用性好，能和所有病原真菌，包括罕见的甚或从未报道过的潜在致病真菌的靶基因匹配，且不与病毒、细菌、寄生虫及人组织细胞发生同源性反应，已报道的几对通用引物因来自高度保守的真菌rRNA基因序列，故均能达