第四军医大学学报1999年第20卷第9期

孙新张国成韩美玉许东亮李飚

摘要目的：研究人微小病毒B19(HPVB19)引致胎肝造血细胞凋亡及凋亡相关基因表达的变化，初步探讨HPVB19引起死胎的机理.方法：采用原位末端标记法对25例石蜡包埋死胎肝脏组织（其中HPVB19DNA阳性者10例，HPVB19DNA阴性者15例）进行细胞凋亡检测，并用免疫组化方法检测bc1-2，bax表达情况.结果：10例HPVB19DNA阳性死胎肝脏组织中8例明显可见造血细胞的凋亡，6例bax表达阳性.15例HPVB19DNA阴性死胎肝脏组织中仅2例有造血细胞的凋亡，2例bax表达阳性，25例均未检出bc1-2的表达.结论：B19感染可能诱导胎肝造血细胞的凋亡，这为可能是该病毒引起胎儿死亡的重要机制.

关键词：微小病毒B19细胞凋亡基因表达胎儿

0引言

孕期人微小病毒B19（HPVB19）感染可引起胎儿水肿、死胎、流产等严重后果.大多数学者认为HPVB19引起胎儿水肿、死胎的机理乃是由于其破坏原始造血细胞（尤其是红细胞生成系统）从而引起胎儿贫血、缺氧、心力衰竭所致^［1］.近年发现，HPVB19在体外可引致造血细胞凋亡，部分学者认为细胞凋亡是HPVB19致病的重要机理之一^［2,3］.胎肝在胚胎期造血中占据相当重要的地位，为探讨HPVB19感染对胎肝造血细胞的影响作用，我们对25例石蜡包埋的死胎肝脏组织中的造血细胞进行了细胞凋亡的原位检测及凋亡相关基因bc1-2，bax的检测，以期进一步阐明HPVB19感染引起死胎的机制.

1材料和方法

1.1材料石蜡包埋死胎肝脏组织来源于本校病理解剖教研室1960～1998年死因不明尸检的25例死胎.孕周20wk～28wk，其中HPVB19DNA阳性者10例，HPVB19DNA阴性者15例.石蜡包埋组织按常规步骤提取DNA后^［4］，经巢式聚合酶链反应(nested-PCR)检测^［5］.玻片以APES处理，5μm连续切片，65℃烤片过夜.原位末端标记检测凋亡试剂盒购自德国Boehringer Mannheim公司，鼠抗人bc1-2单克隆抗体，兔抗人bax多克隆抗体购自SantaCruz生物工程公司，SABC试剂盒、APES，BCIP/NBT购自武汉博士德生物工程有限公司，DAB系英国Sigma公司产品.

1.2方法

1.2.1凋亡细胞的原位末端标记检测石蜡包埋胎肝组织切片常规脱蜡至水，蛋白酶K（20mg/L）37℃消化30min，PBS漂洗后加用荧光素标记的核苷酸和脱氧核苷酸末端转移酶（TdT）混合液37℃60min，荧光显微镜下观察拍照后加碱性磷酸酶标记的抗荧光素抗体，37℃30min；PBS漂洗后加BCIP/NBT避光显色5min～20min，脱水透明后封片光镜观察，以DNaseI处理过的组织切片做阳性对照，阴性对照片仅加荧光素标记的核苷酸液.凋亡细胞的胞核在荧光显微镜下发出亮绿色荧光，经底物BCIP/NBT显色后，在光镜下显紫蓝色，未凋亡细胞的胞核在荧光显微镜下不发出荧光，加显色底物后，胞核亦不着色.

1.2.2凋亡相关基因bcl-2，bax表达的免疫组化检测采用免疫组化SABC法，微波抗原修复，DAB显色.具体操作按博士德公司说明书进行.以已知阳性片做为阳性对照片，以PBS，正常鼠及兔血清代替一抗作空白及替代对照，阳性细胞的胞浆出现棕色颗粒，阳性细胞率＞5%者判为阳性，无阳性细胞或阳性细胞率＜5%者判为阴性.

统计学分析：采用Fisher精确概率检验和χ²检验，经EPI统计软件完成数据处理.

2结果

2.1凋亡细胞检测结果HPVB19 DNA阳性的10例胎肝组织中，有8例均明显可见造血细胞的特异性凋亡染色，阳性率80%（8/10），出现凋亡的造血细胞散在分布于肝血管内，肝窦中以及胎肝造血灶内,胞核呈紫蓝色，部分细胞呈核边聚，核碎裂等特征性凋亡改变（Fig1）.HPVB19阳性的15例胎肝组织中，仅有2例可见造血细胞的凋亡，阴性率13.3%（2/15），两者比较有显著性差异（P=0.0024）.

图1胎肝组织bax阳性造血细胞

fig1bax immunnoreactivity in hematopoietic

cells of fetal liver×1000

2.2凋亡相关基因表达的免疫组化检测结果10例HPVB19DNA阳性胎肝组织中，6例bax染色阳性，阳性率60%（均为凋亡染色阳性者）.阳性细胞的胞浆出现棕色颗粒，分布与凋亡染色细胞分布一致（Fig2）.对照组15例中，仅2例bax染色阳性（其中凋亡染色同时阳性者1例），阳性率13.3%（2/15）两者比较有显著性差异（P＜0.05）.

图2胎肝组织造血细胞凋亡的Tunel检测

fig2Apoptosis of hematopoietic cells

in fetal liver detected by Tunel technique×1000

3讨论

1984年，knott等^［6］首先报道了两例HPVB19感染引起的死胎.此后，国外学者对HPVB19感染与死胎、胎儿水肿、自然流产的关系进行了较为深入的研究.我们的研究业已证实国人孕期HPVB19感染是引起胎儿水肿、死胎的重要原因之一，但是HPVB19引起死胎的机理却尚未阐明.细胞凋亡途径的异常是多种病毒致病的重要机理，如人类免疫缺陷病毒(HIV)、乙型肝炎病毒(HBV)、EB病毒（EBV）、巨细胞病毒(CMV)等的致病机制均与细胞凋亡密切相关^［7］.Morey等^［2］于1993年也发现HPVB19的致病可能与细胞凋亡有关.他在有HPVB19感染与复制的胎肝造血细胞培养中，通过电镜观察到含有HPVB19病毒颗粒的细胞发生了核染色质边聚、凋亡小体形成等典型的凋亡变化.Moffatt等^［3］于1998年构建了稳定表达HPVB19NS₁蛋白（既往认为该蛋白与病毒的细胞毒性有关）的KLNS细胞（红白血病细胞系）和ULNS细胞（依赖促红细胞生成素的巨核细胞系），通过原位末端标记法（Tunel）等证实NS₁可诱导KLNS和ULNS细胞的凋亡.原位末端标记法可以灵敏地检测单个细胞的凋亡，对于早期凋亡亦可准确检出.我们用该法检测25例死胎肝脏组织，发现HPVB19阳性胎肝造血细胞凋亡检出率（8/10）明显高于HPVB19阴性组，提示HPVB19有可能通过激活凋亡途径而导致造血细胞的大量破坏.Moffatt等还发现，除过caspase蛋白酶caspase-3的抑制剂Ac-DEVD-CHO外，bcl-2对NS₁诱导的细胞凋亡亦具有明显的抑制作用.当把bcl-2基因导入KLNS与ULNS细胞后，几乎可以完全阻止由NS₁诱导的细胞凋亡，从而提示bcl-2途径可能参与调节了HPVB19致细胞凋亡的作用.bcl-2与bax同属bcl-2家族成员，它们可以形成异源的二聚体bcl-2/bax等形式，共同调节凋亡的发生与演变.bcl-2是重要的抑凋亡蛋白，可以通过抑制细胞色素C对caspase蛋白酶的激活等作用阻断细胞凋亡的最后共同通道.而bax为促凋亡蛋白，可诱导细胞色素C的释放，激活caspase-3蛋白酶,抑制bcl-2的作用，促进凋亡的发生^［8］.我们的研究发现HPVB19DNA阳性胎肝组织造血细胞bax表达率（6/10）高于HPVB19DNA阴性组（2/15），而bcl-2两组均未见表达，提示HPVB19可能是通过激活bax过表达和/或抑制bcl-2的表达这一途径来实现其致凋亡作用的.国外细胞培养研究与我们对临床标本的检测均提示细胞凋亡可能为HPVB19致病的重要机理之一.HPVB19感染引起胎儿水肿，死胎多发生在妊娠中期，而胎肝在生前，尤其是在妊娠中期，担负着造血的重要职能.由于造血细胞（尤其是红细胞生成系统）表面广泛分布HPVB19病毒细胞受体——红细胞P抗原，故许多作者认为B19引起胎儿水肿、死胎乃是由于其破坏造血细胞导致贫血，缺氧、心力衰竭的结果.本研究进一步提示：HPVB19引起死胎的机理有可能是通过引致胎肝造血细胞的过度凋亡来实现的.有作者认为HPVB19致死胎与病毒性心肌炎有相当关系，而HPVB19亦可感染孕晚期胎儿.因此HPVB19亦有可能通过致心肌细胞凋亡及致孕晚期胎儿骨髓造血细胞凋亡而引起流产、胎儿水肿与死胎，我们正在对此进行更进一步的研究.

基金项目：国家计生委基金资助项目No.9337

作者简介：孙新，男，1972-06-02生，山西万荣县人，汉族.1995年山西医科大学儿科医学系本科毕业，1996年第四军医大学儿科学硕士，导师张国成，韩美玉.Tel：（029）3375400E-mailxjerke@Fmmu.edu.cn

作者单位：第四军医大学西京医院儿科，陕西西安710033

参考文献

1 Shmoys S,Kaplan C. Parvovirus and pregnancy. Clin Obstet Gynecol, 1990;33(2):268-275

2 Morey AL,Ferguson DJP, Fleming KA et al. Ultrastructural features of fetal erythroid precursors infected with parvovirus B19 in vitro: evidence of cell death by apoptosis. J Pathol,1993;169（2）:213-220

3 Moffatt S, Yaegashi N, Tada K et al. Human parvovirus B19 nonstructural(NS1) protein induces apoptosis in erythroid lineage cells. J Virol, 1998;72（