中国现代医学杂志1999年第9卷第4期

吴雪琼庄玉辉黄蓉蓉黄培堂李丰生

用限制性内切酶Pst Ⅰ消化人型结核杆菌H 37Rv DNA，与质粒pUC19 DNA连接后转化大肠杆菌，经同位素32P标记的人型结核杆菌H 37Rv全染色体DNA探针筛选出6个阳性克隆(MT1～6)，其中克隆DNA片段MT2(4.2Kb)、MT4(3.5Kb)和MT5(3.0Kb)标记成探针，检测了22种分支杆菌标准株和15株人型结核杆菌临床分离株以及2种非分支杆菌，其杂交结果完全相同，与人型结核杆菌及其临床分离株杂交阳性，与牛型结核杆菌、卡介苗、堪萨斯分支杆菌、鸟分支杆菌、胃分支杆菌、龟分支杆菌和戈登分支杆菌DNA有交叉杂交，与其它12种分支杆菌以及大肠杆菌、星状诺卡氏菌不杂交。克隆DNA探针可能成为分支杆菌分类、鉴定的一种新工具。

关键词：结核杆菌克隆、DNA探针

分支杆菌分子生物学的研究才刚刚起步，其遗传背景尚不清楚。通过DNA重组技术建立基因库进而研究分支杆菌的基因图谱以及不同基因的特性，是分支杆菌分子生物学研究的重要课题。将为分支杆菌病的基因诊断和化疗打下基础。近年来，国外研究者克隆、鉴定了一些分支杆菌的基因片段，并制备了一些克隆DNA探针，如Patel等^［1］报道了人型结核杆菌pMTb1(1Kb)、pMTb2(0.8Kb)和pMTb3(2.2Kb)克隆DNA的特性；Huang等^［2］制备了堪萨斯分支杆菌pMK1～9克隆(2.2Kb)DNA探针，它只与海分支杆菌有微弱的交叉杂交；Hampson等^［3］用付结核分支杆菌pMBr16，pMB17，pMB20和pMB22四种克隆探针的指纹图谱对鸟分支杆菌复合体的部分血清型进行分析，将它们归为不同的RFLP型。这表明克隆DNA探针不仅可能在基因水平对分支杆菌进行菌种鉴定，而且可通过指纹图谱对分支杆菌进行菌型鉴定，其指纹图谱产生的片段比总DNA探针的少，较容易辨别，有益于流行病学调查。本文介绍了人型结核杆菌克隆DNA探针的制备及其在分支杆菌鉴定中的应用。

1材料和方法

1.1一般资料

1.1.1菌种和质粒本研究所用分支杆菌标准菌株来源于中国药品生物制品检定所；大肠杆菌和质粒pUC19来源于军事医学科学院八所；星状诺卡氏菌由中科院微生物研究所提供。

1.1.2工具酶碱性磷酸酶为Boehringer产品，Klenow酶为New England Biolabs产品，其余均为华美生物工程公司进口分装品。

1.1.3化学试剂普通琼脂糖购自华美和北京中山生物技术有限公司，随机引物为Boehringer产品，［α-32P］ dATP为Promega Biotech公司产品，其余试剂为国产分析纯。

1.1.4硝酸纤维膜(孔径为0.45um)北京化工学校和浙江黄岩人民化工厂产品。

1.2方法

1.2.1细菌培养将受试分支杆菌和非分支杆菌接种于适当培养基上培养。

1.2.2DNA分离、纯化收集分支杆菌菌体，悬浮于2mg/ml溶菌酶溶液中，37℃孵育2h。加链霉蛋白酶E和SDS分别至终浓度1mg/ml和1%(w/v)，在60℃孵育2h以上。用苯酚：氯仿抽提后，加乙醇离心沉淀，将沉淀溶解于适量的TE缓冲液中。质粒pUC19 DNA的分离、纯化参考Maniatis等^［4］的方法。

1.2.3限制性内切酶消化DNA和琼脂糖凝胶电泳限制性酶切反应按照厂家推荐的方法进行，于65℃加热5min终止反应。以EcoRⅠ和HindⅢ消化的λ-DNA为对照，消化的DNA在0.7%或1.2%的琼脂糖凝胶电泳分离后，在紫外灯下观察、照相。

1.2.4DNA片段的回收技术通过电洗脱法回收。Bio-Rad电洗脱回收仪回收法：按厂家介绍的方法进行。透析袋回收法：参照刘宗正介绍的方法^［5］。

1.2.5重组质粒基因库的构建及筛选用限制性内切酶PstⅠ消化人型结核杆菌H37Rv DNA，回收2～8Kb的DNA片段，按Maniatis等介绍的方法^［4］，与PstⅠ消化并经小牛肠碱性磷酸酶处理的载体pUC19重组并转化大肠杆菌JM83，用麦康凯培养基初步筛选转化子，获得的白色菌落用人型结核杆菌H 37Rv全染色体DNA探针通过DNA：DNA杂交反应进一步筛选阳性克隆。

1.2.6探针标记技术

(1) 缺口翻译法：参考Maniatis等介绍的方法，取回收的DNA片段lμg左右，用［α-32P］dATP 30uCi进行标记，探针的比活性约为3-4×107cpm/μg.

(2) 随机引物法：由军事医学科学院八所方继明教授根据厂家推荐的方法建立。一般取回收DNA片段50～200ng，用［α-32P］dATP 20uCi进行标记，探针的比活性约为1010-1011cpm/μg。

1.2.7制备DNA斑点杂交膜和菌落杂交膜参照Bhattacharya^［6］等介绍的方法制备。

1.2.8杂交反应和放射自显影杂交液中探针强度为107-1010cpm，杂交温度为37℃。杂交后置-20℃放射自显影6h～3d。

1.2.9Southern转移根据刘宗正介绍的方法^［5］，将DNA转移到硝酸纤维膜上(孔径0.45μm)与探针杂交。

2结果

2.1阳性克隆的筛选

用麦康凯培养基初步筛选转化子，获34个白色菌落。将所有的白色克隆与人型结核杆菌H 37Rv全染色体DNA探针进行菌落原位杂交和DNA：DNA斑点杂交，进一步筛选出6个阳性克隆(MT1～6)见图1。EcoRⅠ和HindⅢ消化的λ-DNA为对照。经PstⅠ酶切电泳分析，MT1，2，3的插入片段约为4.2Kb,MT4的约3.5Kb，MT5,6约3.0Kb。Southern转移杂交证实，人型结核杆菌全染色体DNA探针只与MT2,4,5的插入片段杂交，而不与载体pUC19 DNA片段杂交。

2.2MT2，4，5克隆DNA探针的特异性

回收MT2，4，5重组子的插入片段，用同位素32P标记成探针，与22种分支杆菌标准菌株和15株人型结核杆菌临床分离株以及2种非分支杆菌于37℃进行杂交。三个探针的杂交情况完全相同，与人型结核杆菌标准菌株和15株临床株杂交呈强阳性；与大肠杆菌、星状诺卡氏菌不杂交；与猿分支杆菌、胞内分支杆菌、瘰疬分支杆菌、不产色分支杆菌、土分支杆菌、蟾分支杆菌、次要分支杆菌、牡牛分支杆菌、偶发分支杆菌、淡黄分支杆菌、耻垢分支杆菌和草分支杆菌杂交阴性；但与牛型结核杆菌、卡介苗、鸟分支杆菌、堪萨斯分支杆菌、胃分支杆菌、龟分支杆菌和戈登分支杆菌有交叉杂交。MT5探针与MT1，2，3，4，6克隆DNA都有交叉杂交。我们将克隆DNA探针的杂交结果与全染色体DNA探针进行了比较见附表。

2.3MT4克隆DNA的特性

用下列限制性内切酶消化MT4 DNA或插入片段：BamHⅠ，Bc1Ⅰ，Bg1Ⅱ，EcoRⅠ，HindⅢ，Sau3AⅠ和XhoⅠ，只有Bg1Ⅱ和EcoRⅠ有酶切位点，见图2。EcoRⅠ消化MT4的插入片段(3.5Kb)可产生一个3.0Kb的大片段和一个0.5Kb的小片段。Bg1Ⅱ的酶切位点在EcoRⅠ消化MT4插入片段所产生的小片段上。

2.4次级克隆MT4A，B，C

用EcoRⅠ消化MT4的插入片段与质粒pUC19重组并转化大肠杆菌JM83，用麦康凯培养基筛选出6个白色菌落，与MT4 DNA探针进行菌落原位杂交和DNA斑点杂交，进一步筛选出3个阳性重组子(MT4A，B，C)。经EcoRⅠ和PstⅠ双酶切电泳分析证实，MT4A，B，C的插入片段相同，均为0.5Kb的小片段。回收MT4A插入片用同位素32P标记成探针，该探针与人型结核杆菌H 37Rv和质粒pUC19 DNA杂交都很弱。

3讨论

分支杆菌基因克隆的关键是选择合适的载体宿主系统。大肠杆菌、变铅链霉菌和分支杆菌都可作为分支杆菌基因克隆、表达的宿主^［1，7］，但我们构建的质粒基因库最终只获得6个阳性克隆，说明分支杆菌DNA片段较难转入大肠杆菌。我们曾应用变铅链霉菌作为宿主成功地构建了BCG质粒基因库，获得近千个阳性克隆。

MT2，MT4和MT5克隆DNA探针的杂交结果完全一样，而且相互间有交叉杂交，表明3个克隆的插入片段有一部分是重叠的。这3个克隆DNA探针检测大肠杆菌和星状诺卡氏菌完全不杂交，进一步证明了人型结核杆菌DNA与非分支杆菌DNA之间同源性很低的报道^［8～10］。不同菌属的DNA之间有80%以上的DNA单一序列不同，因此用人型结核杆菌DNA探针进行检测一般不会把非分枝杆菌误为分支杆菌。这些克隆DNA探针与大多数受试的分支杆菌也不杂交，其中包括与人型结核杆菌DNA有较高同源性的分支杆菌，如胞内分支杆菌、瘰疬分支杆菌、蟾分支杆菌等^{［11，12］}，但能够识别一些其它分支杆菌DNA系列，如牛型结核杆菌、卡介苗、堪萨斯分支杆菌、鸟分支杆菌、胃分支杆菌、龟分支杆菌、戈登分支杆菌。与全染色体DNA探针^［9］比较特异性较差(见附表)，而且温度对克隆DNA探针杂交结果无显著影响，说明它与强杂交的分支杆菌之间的同源性很高，升高杂交温度不能提高它的特异性。次级克隆MT4A(0.5Kb)与原始菌株人型结核杆菌H 37Rv DNA杂交很弱，表明DNA片段小，所带的标记物也少，在与全染色体DNA杂交时所显示的杂交信号也就弱。

我们将进一步应用这些克隆DNA片段进行分支杆菌指纹图谱分析，了解它们在不同分支杆菌中的存在情况，希望能够为结核病的流行病学调查及分支杆菌的分类、鉴定提供一种新方法。