【摘要】目的探讨中国人中存在的错配修复基因hMLH1 Val384Asp在大肠癌、胃癌、食道癌发病中的作用。方法中国汉族人101例大肠癌患者、79例胃癌患者、76例食道癌患者、79例和76例胃癌和食道癌患者的亲属、100名正常对照，各取正常体细胞，提取基因组DNA。PCR-SSCP和DNA序列分析技术检测hMLH1基因的第12外显子，比较分析Val384Asp的检出率。结果6%的正常人携带hMLH1基因Val384Asp；小于45岁的大肠癌患者中hMLH1基因Val384Asp的检出率高于正常对照(P＜0.05)；显著性差异还存在于具有癌症家族史的胃癌患者及其亲属与正常对照的比较(P＜0.05和P＜0.01)；食道癌患者及其亲属与正常对照之间的比较无显著差异(P＞0.05)。结论中国汉族人中hMLH1基因Val384Asp等位基因频率约3%，这一错义突变可能在中国人部分大肠癌、胃癌的发病中起作用。

One of the etiological factors of digestive tract cancers in Chinese: the missense mutation Val384Asp in the hMLH1 gene^*

WANG YapingZHOU JiannongLI ZhongyouWANG JiandongLI JintianGAO Changming

GAO Ping.

(Jiangsu Institute of Cancer Research, Nanjing, Jiangsu,210009 P.R. China. E-mail:wangyapn@jlonline.com)

【Abstract】ObjectiveTo investigate the etiological role of Val384Asp in the hMLH1 gene, which may be a polymorphism in Chinese, in colorectal,gastric and esophageal cancers. MethodsGenomic DNA extracted from normal tissues were subjected to analysis in exon 12 of the hMLH1 gene by single strand conformation polymorphism(SSCP) followed by DNA sequencing of aberrant bands in 101 colorectal, 79 gastric and 76 esophageal cancer patients; in 79 and 76 first degree relatives of gastric cancer and esophageal cancer patients respectively; and in 100 healthy control individuals. ResultsSix percent of Chinese healthy individuals were the carriers of Val384Asp in the hMLH1 gene. There were significant differences in the frequencies of Val384Asp in the hMLH1 gene between the patients with colorectal cancer at young age(＜45 years) and the control individuals (P＜0.05), and between the gastric cancer patients with family history, the first degree relatives and the control group (P＜0.05 and P＜0.01 respectively). No difference was found between the esophageal cancer patients, their relatives and healthy controls.ConclusionThe alleles frequency of Val384Asp in the hMLH1 gene in Chinese is three percent. This missense mutation may play a part in the etiology of colorectal and gastric cancers in Chinese.

【Key words】hMLH1 gene;missense mutation;Val384Asp;etiology;digestive tract cancers

遗传性非息肉性大肠癌(hereditary nonpolyposis colorectal cancer,HNPCC)是一种遗传预置性(predisposition)疾病，呈常染色体显性遗传。在HNPCC家庭成员中，除大肠癌聚集发生外，胃癌、子宫内膜癌、卵巢癌、乳腺癌等的发病亦明显高于一般人群^［1，2］。近年来，HNPCC的发生与错配修复基因突变之间的关系得以确认^［3，4］。通过在HNPCC患者中检测错配修复基因的突变，对HNPCC患者的家庭成员进行遗传咨询和基因诊断成为可能。对于已发现的某些突变，评价它的病因作用并不困难，如移码突变、无义突变，然而对于某些由单个碱基置换而导致的错义突变，有时难以确定其临床意义^［5，6］。我们最近首先在大肠癌患者检出错配修复基因hMLH1遗传性(germline)错义突变Val384Asp，初步研究表明这一突变可能影响其携带者大肠癌的发病年龄^［7，8］。为进一步探明hMLH1基因val384Asp的病因学作用，我们对不同消化道肿瘤患者及其亲属中hMLH1基因Val384Asp的存在状况进行了比较。

1材料和方法

1.1检测的样本

1.1.1大肠癌患者101例大肠癌患者，男60例，女41例。1例符合HNPCC临床诊断标准，2例由家族性多发性结肠息肉病恶性转化而来，余为散发性大肠癌患者。发病年龄23～77岁，其中小于45岁的患者30例，大于或等于45岁的患者71例。每例患者取外周静脉血(61例)或手术切除的远离癌灶的正常组织(40例，病理排除癌细胞浸润)。

1.1.2胃癌患者79例胃癌患者，男58例，女21例，年龄30～79例。其中具有癌症家族史(至少有1名一级亲属罹患癌症)的患者24例；无明确癌症家族史的患者55例。每例取外周静脉血。

1.1.3食道癌患者76例食道癌患者，男42例，女34例，年龄40～78岁。其中具有癌症家族史(至少有1名一级亲属罹患癌症)的患者27例，无明确癌症家族史的患者49例。每例取外周静脉血。

1.1.4癌症患者亲属的样本每例胃癌、食道癌患者均随机取其1位健康亲属(父母、同胞或子女，一级亲属)的外周静脉血。胃癌患者的亲属，男58例，女21例，年龄6～70岁；食道癌患者的亲属，男58例，女18例，年龄14～75岁。

1.1.5正常对照100名对照为正常健康人，其一级亲属中无明确的癌症患者，男71例，女29例，年龄17～70岁。各取外周静脉血。

1.1.6样本的民族及地区来源检测的样本为中国汉族人。大肠癌患者为近三年来我所就诊的患者，主要来自江苏北部和西部地区， 安徽北部和东部地区；胃癌患者及其亲属、食道癌患者及亲属以及正常对照均取自江苏北部地区。

1.1.7DNA提取血样本以全血细胞提取DNA；组织样本研磨后，酚、氯仿法抽提DNA。

1.2PCR-SSCP每例样本均由1对引物特异性地扩增hMLH1基因第12外显子上游-4位碱基至第12外显子内第1251位碱基(216bp)。引物序列：5′-ACAGACTTTGCTACCAGGACTTG-3′(上游)；5′-TGTCTTATCCTCTGTGACAATGG-3′(下游)。

PCR反应体积25 μl，其中模板DNA 60 ng,4×dNTPs终浓度各0.2 mmol/L,MgCl₂的浓度1.5 mmol/L,Taq酶1～1.5U。循环条件，94℃预变性5 min后，94℃40 s，55℃40 s，72℃60 s，35个循环周期，72℃延长10 min。取PCR产物6 μl加6 μl加样缓冲液，95℃变性5 min后立即置冰上，行10%聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳条件：电泳缓冲液0.5×TBE，电压70V，环境温度4℃，持续时间18～20 h。 电泳结束后凝胶用0.2%的硝酸银染色^［6］。

1.3DNA序列分析SSCP分析出现异常带型的病例，相应的PCR产物直接测序(Amersham,Version 2.0 DNA Sequencing Kit)。

1.4统计学方法各组之间hMLH1基因Val384Asp检出率的比较、等位基因频率的比较及Odds Ratio(OR)值的计算采用Epi Info 6.04b统计软件。

2结果

2.1SSCP和DNA序列分析100名正常对照者中6人出现异常电泳带型。相同的异常带型见于13/101的大肠癌患者、11/79的胃癌患者、7/76的食道癌患者、14/79的胃癌患者亲属和6/76的食道癌患者亲属(图1，表1)。DNA序列分析表明，这一异常带型的出现是由于hMLH1基因第12外显子内的第1151位碱基存在遗传性的碱基颠换(T→A，杂合型)，使该碱基所处的第384位密码子发生错义突变(GTT→GAT，Val384Asp,图2)。

2.2分组分析我们将大肠癌患者根据发病年龄(以45岁为界)分为两组；对胃癌、食道癌患者和胃癌患者亲属、食道癌患者亲属根据有无癌症家族史分别分为两组，计数Val384Asp的检出率(表2)。

2.3统计分析的结果

2.3.13种消化道肿瘤患者组、2种肿瘤患者亲属组与健康人群比较各肿瘤患者组、患者亲属组中hMLH1基因Val384Asp检出率分别与正常对照进行比较，结果仅胃癌患者亲属组与健康人群之间的差异具有显著性(P＜0.05，表1)。

2.3.23种消化道肿瘤患者、2种肿瘤患者亲属分组后的组间比较分组情况见表2。组间比较表明，胃癌患者亲属中具有癌症家族史的人群与无癌症家族史的人群之间具有显著差异(P＜0.05，表2)。

2.3.3大肠癌患者分组后与正常对照的比较我们检出的hMLH1基因Val384Asp均为杂合型。我们以等位基因概念比较两组大肠癌患者中Val384Asp等位基因频率与健康人群的差异。结果表明，hMLH1基因Val384Asp在发病年龄较低(＜45岁)的患者中检出率较高(P＜0.05)；而发病年龄≥45岁的大肠癌患者中Val384Asp的检出率与正常对照之间无显著差异(P＞0.05，表3)。

图1hMLH1基因第12外显子的SSCP1～4、7～9：野生型基因片段；5、6：两例Val384Asp携带者的样本，显示变异的SSCP带型

2hMLH1基因第12外显子序列分析两例中国人大肠癌患者，携带hMLH1基因Val384Asp(杂合型)，箭头示存在于1151位碱基的颠换T→A，<