【摘要】目的探讨人类连接蛋白基因26(connexin 26,Cx26)的调控机理。方法对Cx26基因转译起始点上游的一个DNase-1超敏区片段1.6kb进行序列分析和CAT报告基因分析。结果Cx26-1.6kb片段具有启动子功能。结论Cx26-1.6kb中含有2个GT盒(分别位于-6158bp和-6213bp)，1个TTAAAA盒位于-6237bp，这是在人类Cx26基因中新发现的第2个启动区。

A new potential promoter region of the human connexin 26 gene^*

PENG BailuZHANG XunZHOU MingZENG ZhaoyangLI Guiyuan

(Cancer Research Institute,Hunan Medical University, Changsha,Hunan, 410078 P.R. China. E-mail: Ligy@public.cs.hn.cn)

【Abstract】ObjectiveTo explain regulatory mechanism of the human connexin 26(Cx26) gene. MethodsA DNase-1 hypersensitive 1.6kb fragment upstream of the 5′-terminus of the Cx26 gene was sequenced and assayed with CAT reporter system. ResultsThe Cx26-1.6kb sequence serves as a powerful promoter.ConclusionThe Cx26-1.6kb fragment contains two GT boxes (centering at -6158 and -6213 bp), and a TATA-less TTAAAA box (-6237/-6232 bp)which is another promoter region of the human Cx26.

【Key words】Cx26 gene promoter;sequencing;CAT reporter assay

连接蛋白基因(connexin gene,Cx gene)是细胞间隙连接蛋白基因。Cx基因是一个多基因家庭，不同的连接蛋白由位于不同染色体上的Cx基因编码^［1］。在乳腺内腔上皮细胞中，主要表达的Cx基因是Cx26^［2］。用递减杂交技术发现Cx26只在正常乳腺上皮细胞系中表达^［3］，而在恶性细胞系中不表达，用原位杂交技术对人类乳腺组织进行研究也证实在癌细胞中Cx26的表达下降^［4］。将Cx26基因转染到癌细胞中，则抑制其生长，并恢复其分化潜能^［5］。所以，Cx26已被看作抑瘤基因的候选者。

尽管Cx26基因在乳腺发育过程中可能起关键的生理和病理作用，但只有其编码区(外显子2)在小鼠、大鼠 和人类中得到深入研究^［6］，对人类乳腺癌中Cx26基因调控的研究由于缺乏其全长序列而受到制约，为此李桂源等^［7］克隆了人类Cx26基因gDNA序列，并对ATG起始点上游-4800bp进行了序列测定和功能研究，绘制出了人类Cx26基因的图谱。

我们利用在克隆的人类Cx26基因全长gDNA材料，对Cx26基因ATG起始点上游-4800bp之前的一个1.6kb的DNase-1超敏区片段进行研究，期望进一步阐明人类Cx26基因的调控机理。

1材料与方法

1.1材料乳腺癌细胞株MDA-MB-134从美国模式培养物保藏所(American Type Culture Collection,Rockville,MD)获得。DNA限制性内切酶和修饰酶购自Promega公司，脂质体转染剂Lipofectamine为Gibco/BRL产品，乙酰-CoA购自Sigma公司，¹⁴C-氯霉素购自杜邦公司(Dupont,NEN,美国)。

1.2方法

1.2.1质粒DNA的纯化与序列测定人类Cx26基因转译起始位点上游-6.4kb～-4.8kb的1.6kb序列已克隆在pGEM-4Z质粒载体中。质粒经扩增，用碱裂解法抽提DNA后经PEG₈₀₀₀纯化，溶于适量TE中。测定吸光度A₂₆₀(旧称光密度OD)以确定其浓度，经琼脂糖凝胶电泳确定其纯度。样品在全自动测序仪(全自动荧光测序仪377型，美国PE公司)上测序。在联网Internet中运用Basic blast程序与目前所有已知的核苷酸序列进行同源匹配，以确定所测序列是否为新序列。

1.2.2pCAT vector-Cx26-1.6kb重组体的构建将Cx26-1.6kb分别与pCAT enhancer vector和pCAT promoter vector重组，以分别观察其启动功能和增强功能。 采用平端连接，则可构建插入片段具有不同插入方向的重组体。用来自pGEM-4Z亚克隆的Cx26-1.6kb片段，分别平端连接、重组到pCAT enhancer vector和pCAT promoter vector的多克隆位点处的XbaⅠ位点中。转化后挑选单菌落扩增，用DNA限切酶鉴定阳性转化子及重组体类型。

1.2.3脂质体介导重组体DNA转染哺乳细胞10 cm平皿中培养的MDA-MB-134乳腺癌细胞达80%汇合时用于脂质体介导的重组体DNA转染。在少量无血清培养基中混合重组体DNA和脂质体以形成DNA-脂质体复合物。细胞经洗涤后加入DNA-脂质体复合物。37℃培养数小时后，洗去DNA-脂质体复合物，换上新鲜完全培养基，继续培养至收获。

1.2.4CAT报告基因分析经重组体DNA转染的MDA-MB-134乳腺癌细胞培养48 h后离心收获细胞，细胞悬浮在少量0.25mol/L Tris·Cl pH7.5中，经历3次冻融循环后，离心沉淀，取上清，获得细胞抽提物。细胞抽提物经65℃加热10 min以失活内源乙酰辅酶A。在反应管中加入¹⁴C-氯霉素，acetyl-CoA，转染细胞抽提物及缓冲溶液以建立CAT反应系统。37℃温育约2 h后，用乙酸乙酯抽提乙酰化氯霉素，真空抽干后溶于少量乙酸乙酯中，各样品点样在硅胶薄层层析板距底缘2 cm高处，晾干后在氯仿∶甲醇(95∶5)中层析约1 h。层析板晾干后放射自显影3 d。

2结果

Cx26基因5′-端上游1.6kb克隆于pGEM-4Z EcoRⅠ/Pst Ⅰ位点上。质粒DNA经纯化后，经全自动荧光测序仪测定，其DNA核苷酸序列见图1。将图1中的Cx26-1.6kb序列在联网Internet中运用Basic blast程序与目前所有已知的核苷酸序列进行同源匹配，得到最大Score值为42，最小P(N)为0.26，按两序列间Score值＞200，P(N)＜0.05为有意义同源性比较，则Cx26-1.6 kb为一新序列，此序列在Genbank中的登录号为AF091526。

载体pCAT promoter vector和pCAT enhancer vector用Xba Ⅰ线性化并进行去磷酸化反应，从亚克隆中酶切、电泳回收Cx26-1.6kb片段后，均用Klenow大片段补齐粘末端。Cx26-1.6kb分别与pCAT promoter vector和pCAT enhancer vector连接，经转化、筛选，获得按正方向插入的pCAT promoter-Cx1.6 kb重组体(PF)，按反方向插入的pCAT promoter-Cx1.6 kb(PR),按正方向插入的pCAT enhancer-Cx1.6 kb重组体(EF)，和按反方向插入的 pCAT enhancer -Cx1.6kb (ER)。这四种重组体的限切酶鉴定见图2。各重组体DNA经脂质体介导转染到MDA-MB-134乳腺癌细胞株中，经培养、收获细胞后，进行CAT反应。CAT反应产物通过薄层层板(图3)。如图3所示，ER转染抽提物具有强烈的CAT活性，说明Cx26-1.6 kb具有强烈的启动子功能。ER作为Cx26-1.6kb在pCAT enhancer vector中反向插入的重组体而表现出要求正向顺序才具有的启动功能，说明Cx26-1.6 kb原本是反向亚克隆在pGEM-4Z载体中的。而与此插入方向相反者EF的CAT活性小得多，此1.6kb片段也没有表现出增强子功能。据此，图1中的DNA序列即是按功能方向排列的。

图1人类Cx26基因ATG转译起始点远端上游1.6kb的DNA序列(A)和人类Cx26基因的结构简图(B)有下划线部分为TATA-less TTAAAA box和GT boxes

Fig 11.6 kb DNA sequence located 5′upstream of ATG translation start site of the human Cx26 gene(A) and map of the human Cx26 gene(B)The sequence of TATA-less TTAAAA box and GT boxes are underlined

图2pCAT vector-Cx1.6重组体的鉴定1：PF/XbaⅠ+PstⅠ；2：PR/XbaⅠ+PstⅠ；3:EF/XbaⅠ+PstⅠ；4：ER/XbaⅠ+PstⅠ;5:λDNA/HindⅢ+pGEM 7Zf(+)/HaeⅢ markers

Fig 2 Identification of pCAT vector-Cx1.6 recombinants 1:PF/XbaⅠ+PstⅠ;2:PR/XbaⅠ+PstⅠ;3:EF/XbaⅠ+PstⅠ;4:ER/XbaⅠ+PstⅠ;5:λDNA/HindⅢ+pGEM 7Zf(+)/HaeⅢ markers

图3Cx26-1.6kb的CAT报告基因分析

1：pCAT enhancer vector;2:PF;3:PR;4:EF;5:ER;6:pCAT control vector

Fig 3 CAT reporter assay of Cx26-1.6kb 1:pCAT enhancer vector;2:PF;3:PR;4:EF;5:ER;6:pCAT control vector

3讨论

连接蛋白26(Cx26)是乳腺上皮细胞中主要的间隙连接蛋白，其编码基因已被看作一个肿瘤抑制基因。尽管乳腺癌细胞株中Cx26的表达是下调的^［3，4］，但泌乳期间其表达上调^［2］。因此，Cx26基因可能在乳腺发育中起重要的病理生理作用。

到目前为止，在对人类Cx26基因外显子2序列进行了描述的基础上^［6］，Kiang等^［8］用cDNA克隆和引物延伸技术对Cx26上游的4.8kb片段进行了作图和测序。分析发现此片段含有启动子区、转译起始点、外显子1和内含子1。CAT报告基因分析结果表明，启动CAT活性的DNA序列在直接靠近转译起始点上