【摘要】目的用分子细胞遗传学技术鉴别常规细胞遗传学难以确定的染色体异常。方法用染色体涂染、比较基因组杂交(comparative genomic hybridization,CGH)和多色显带分析技术(colorbanding chromosome analysis,RxFISH),对一例G显带提示为9号染色体结构异常的病例进行研究。结果患儿核型为46，XX，9p+,染色体涂染显示两条9号染色体(包括短臂额外片段)被均匀涂染，CGH和RxFISH证实为9号短臂完全重复，核型准确描述为46，XX，dup9p(p11→p24∷p24→qter)。结论这些技术手段可以鉴别常规细胞遗传学难以进行诊断的、复杂的染色体结构异常，在基础及临床医学研究领域中，有着重要的应用前景。

Determination of trisomy 9p by molecular cytogenetic technology

DING Xiuyuan,Despina Sanoudou,YANG Fengtang,CHEN hong.Department of Genetics,Capital Institute of Pediatrics,Beijing, 100020 p.R.China.E-mail:cip@public.intercom.com.cn

【Abstract】ObjectiveTo use molecular cytogenetic techniques for the determination of complex chromosomal aberrations that could not be distinguished by conventional cytogenetic method.MethodsChromosome painting,comparative genomic hybridization(CGH) and color banding chromosome analysis(RxFISH) were used to identify a case with chromosome 9 aberration by G-banding.ResultsThe patient has a karyotype of 46,XX,9p+ by G-banding.Both chromosomes 9 were uniformly painted,including the extra segment on one of the 9p alleles.CGH revealed a duplication of the entire 9p short arm.After analysis with RxFISH the patient's karyotype could be accurately described as46,XX,dup9p(p11→p24∷p24→qter).ConclusionThe present report shows that some late technological developments in the field of cytogenetics can facilitate the study of the diseases linked to complex chromosomal aberrations and may find significant application in basic and clinical medical studies.

【Key words】Chromosome paintingComparative genomic hybridizationColor banding chromosome analysisChromosomal aberration

1970年Rethor é等首先用显带技术识别证实了9p三体核型，并描述了三体综合征的临床特征^［1］。至今已报道的9p三体综合征约有100余例，是比较常见的常染色体异常综合征，其发病率仅次于21、13和18三体综合征。我们结合染色体涂染(chromosome painting)、比较基因组杂交(comparative genomic hybridization,CGH)和多色显带分析技术(color banding chromosome analysis,RxFISH)等最新的分子细胞遗传学手段，对一例G显带提示为9号染色体结构异常的病例进行研究，确诊为9p三体综合征，现报告如下。

1材料与方法

1.1病例女，4岁，因智力低下就诊。患儿系第1胎足月剖腹产(因胎心弱)，母孕期正常，出生时母亲年龄38岁，父亲41岁。患儿5个月能认父母，但至今不能分辨陌生人与熟人，不会说话；3岁会独立行走，现仍步态不稳；大小便可控制，无特殊疾病史；6个月时行唇裂修补术。家庭成员无类似病史，父母非近亲婚配。查体：身高93cm,体重15.5kg，发育欠佳，表情呆傻。头型无异常，眼距宽，无斜视及震颤，耳位低，左侧有唇裂修补疤痕，腭弓高耸，腭裂，无颈蹼。胸廓对称无畸形，心尖部闻及Ⅱ级收缩期杂音，律齐。双手通贯纹，各指骨短，小指两屈曲褶纹合并，无名指及小指内弯屈曲，双足第2、5趾甲发育不良。泌尿生殖系统及神经系统无异常。B超示房间隔缺损，脑CT检查疑脑白质发育不良。

1.2方法

1.2.1细胞遗传学检查取患儿及其父母外周血，按常规方法进行淋巴细胞培养及染色体制备，并行G显带分析。

1.2.2染色体涂染生物素标记的正常人整条9号染色体涂染探针，由英国剑桥大学病理系人类分子遗传研究室馈赠。取出-20℃保存的染色体悬液滴片，65℃烤片1小时，100%乙醇脱水5分钟，室温干燥。再于70%甲酰胺、2×SSC中65℃变性1分30秒～2分钟后，迅速置于-20℃70%冷乙醇中5分钟，经系列乙醇脱水，气干待用。探针50～100ng与含有50%甲酰胺、10%葡聚糖硫酸酯、Cot-1 dNA的杂交液混合，65℃变性10分钟，转入37℃重退火30分钟后，滴在玻片上，封片后置湿盒内，42℃杂交过夜。杂交后移去盖片，于45℃水浴中将玻片依次置于50%甲酰胺、2×SSC，2×SSC，0.1×SSC，4×T(4×SSC、0.05%Tween20)中漂洗。然后滴加1∶500稀释的亲和素-Cy3,37℃孵育30分钟，4×T洗涤后，DAPI复染，抗粹灭甘油封片，荧光显微镜下观察。

1.2.3CGH按常规酚/氯仿抽提法从患儿及正常对照的外周静脉血中提取基因组DNA，分别用生物素和荧光素(FITC)进行标记，标记的DNA探针同时杂交到正常男性染色体分裂相上。杂交及检测过程同染色体涂染，区别之处：37℃杂交3～4天；患儿DNA的检测采用绿色荧光素，依次滴加1∶200稀释的兔抗FITC，1∶100稀释的羊抗兔FITC，37℃孵育，每次30分钟，正常对照DNA则采用红色的亲和素-Cy3作为检测；分析采用Vysis公司的定量图象分析软件(quantitative image processing system,QUIPS)。

1.2.4RxFISH用3种不同颜色的荧光素标记、经流式仪分离获得的长臂猿各染色体DNA，制备成探针，按染色体涂染的方法与患儿的染色体分裂相杂交，经不同检测试剂的组合，产生7种颜色，对染色体进行彩色显带。采用Applied imaging公司软件进行分析(本研究中CGH和RxFISH两部分工作在英国剑桥大学病理系人类分子遗传研究室FISH组完成)。

2结果

细胞遗传学G显带分析显示：患儿父母为正常核型，分别为46，XY和46，XX。患儿核型为46，XX，9p+，即每个分裂相均有一条9号染色体短臂延长，增加了一条额外深带(图1a)。为探明额外染色体片段的来源，采用9号染色体涂染探针进行染色体涂染，结果显示两条9号染色体(包括短臂额外片段)被均匀涂染(图1b，图2)，其它染色体未见杂交信号，因此除外了存在染色体易位或插入的可能性，提示有染色体内重复。CGH证实该额外片段为9号短臂完全重复(图1c)。RxFISH的结果将患儿的核型准确地描述为46，XX，dup9p(p11→p24∷p24→qter)(图1d、图3)。

图1患儿9号染色体经4种方法分析的结果a：G显带，右侧为异常的9号染色体；b：染色体涂染结果；c：CGH；d：RxFISH的结果

fig 1The results of chromosome 9 by four methodsa：G-banding,the abnormal chromosome 9 (right);b：chromosome painting；c：CGH;d：RxFHSH

图2患儿染色体涂染结果

fig 2The result of chromosome painting

图3患儿染色体RxFISH

Fig 3The result of RxFISH

3讨论

荧光原位杂交(FISH)技术是90年代初发展起来的，它采用非同位素方法将DNA技术与传统细胞遗传学方法相结合，使细胞遗传学的研究进入了分子细胞遗传学的发展阶段。近年来，相继问世的染色体涂染、CGH和RxFISH等新技术，更使FISH技术得到了不断的创新和发展。本研究中，我们将这几项新技术用于常规G显带技术难以确定的染色体结构异常的临床病例研究，取得了令人信服的结果。在染色体涂染中所使用的整条9号染色体涂染探针，是采用兼并引物PCR(degenerate oligonucleotide primed PCR，DOP-PCR)的方法，对经过流式仪分离获得的9号染色体进行标记。DOP-PCR的引物设计为3′端的6个特异序列碱基与6个兼并碱基结合，在PCR扩增的头5个循环采用低退火温度(30℃)。这两个特点使DOP-PCR的标记方法比以往采用的以Alu重复序列为基础的PCR标记具有突出的优点：(1)DNA的扩增不受DNA种类和复杂性的影响，DOP-PCR可用于各种DNA模板的标记；(2)标记效率高，染色体涂染均匀^［2］。通过使用整条染色体特异探针进行染色体涂染，对于复杂的或小片段的染色体易位、缺失、断裂以及鉴别标记染色体的来源等，都可以作出准确的判断。在CGH分析中，患儿的DNA标记成绿色，正常参考DNA标记成红色，与正常染色体分裂相杂交，通过分析绿色与红色的比率，显示9号染色体短臂绿色比值增高，定量分析表明增加了1个拷贝，为9号短臂重复。同理，如果显示红色比值增高，则表明有片段缺失。CGH技术是在基因组水平上，将对变异部位的检测与染色体定位相结合，进行准确的定量定位分析，并且不需要细胞培养，特别适合用于恶性肿瘤获得性染色体结构异常的研究^［3］。RxFISH技术也可以定义为种交叉彩色显带分析技术(cr