【摘要】目的探讨早老素-1基因突变在散发性Alzheimer病(sporadic alzheimer's disease, SAD)患者发病机理中的作用。方法应用聚合酶链反应-单链构象多态性(polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphsim,PCR-SSCP)及DNA直接测序技术检测68例SAD患者和65名正常老年人的早老素-1基因第5外显子。结果发现68例SAD患者中有4例患者的SSCP发生泳动异常，DNA序列分析发现：这4例SAD患者的130号密码子发生了CTG→ATG错义突变(388位点发生C→A突变)，使氨基酸由亮氨酸变为蛋氨酸(Leu130 Met)；157号密码子发生了GTG→CTG错义突变(469位点发生G→C突变)，使氨基酸由缬氨酸变为亮氨酸(Val157 Leu)；有11例患者的SSCP表现为一条单链电泳迁移率明显增快，DNA序列分析发现：这11例SAD患者的130号密码子发生了CTG→ATG错义突变(388位点发生C→A突变)，使氨基酸由亮氨酸变为蛋氨酸(Leu130 Met)；154号密码子发生了TGC→TGT同义突变(462位点发生C→T)突变。结论我们发现在SAD患者中存在早老素-1基因第5外显子突变，该突变点可能为中国人SAD患者早老素基因突变点之一。

A study on mutation of exon 5 of presenilin-1 in Alzheimer's disease

MA Qiulan, QIAN Caiyun, LIU Zhuolin, LU Xilin, LIN Hongchuan. department of Neurology, The First Affiliated Hospital, Sun Yat-sen University of Medical Scinece, Guangzhou 510080 P.R.China.

【Abstract】ObjectiveTo explore the role of the mutation of presenilin-1 in pathogenesis of sporadic Alzheimer's disease.MethodsThe exon 5 of presenilin-1 was analysed by using ploymerase chain-reaction single strand conformation polymorphism(PCR-SSCP) and ABI 310 genetic analyzer technique in 68 patients with Alzheimer's disease and 65 normal controls.ResultsA mobility shift of SSCP in exon 5 of presenilin-1 was detected in 4 patients with Alzheimer's disease;two missense mutations were found. One mutation was at Leu 130 Met and the other at val157 Leu.Another mobility shift of SSCP in exon 5 of presenilin-1 was detected in 11 patients with Alzheimer's disease. One missense mutation was at Leu 130Met and one same sense mutation C462→T. But no mobility shift of SSCP was found in patients with vascular dementia and in normal controls.ConclusionThe authors found that mutations in exon 5 of presenilin-1 also existed in patients with sporadic Alzheimer's disease, which might be one of the points of mutations in sporadic Alzheimer's disease in Chinese.

【Key words】Alzheimer's diseasePresenilin-1MutationGenetics

最近研究发现，多数早发性家族性阿尔茨海默氏病(familial alzheimer's disease,FAD)与14号染色体上的早老素-1(presenilin-1,PS-1)基因突变有关^［1］，少数早发性FAD与PS-2基因突变有关。早老素基因与散发性Alzheimer病(sporadic alzheimer's disease,SAD)的关系，目前国内外研究较少，为探讨PS-1基因突变在SAD发病机理中的作用，我们用聚合酶链反应-单链构象多态性(polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism, PCR-SSCP)、DNA直接测序技术检测了68例SAD患者及65名正常老年人PS-1基因第5外显子，发现在SAD患者中也存在PS-1基因第5外显子突。

1对象和方法

1.1研究对象

1.1.1AD组68例，男22例，女46例，平均年龄79±8岁。全部病例从广州市老人院中筛选，应用简易精神状态量表(mini mental state examination,MMSE)、长谷川痴呆量表(Hasegawa dementia scale, hDS)进行痴呆筛选调查，采用美国国立神经病、语言机能紊乱和卒中研究所及阿尔茨海默氏病和相关疾病协会(the national Institute of Neurological and Communicative Disorders and Stroke and the Alzheimer's Disease and Related Disorders Association, ADRDA-NINCDS)临床诊断标准，把诊断为‘可能性AD’的患者列为研究对象，全部患者无血缘关系。MMSE痴呆判断标准为：文盲组＜17分，小学组＜20分，中学以上组＜24分，哈金斯基缺血量表(the hachinski ischemic scale, HIS)缺血指数＜4分。

1.1.2正常对照组65人，男30人，女35人，平均年龄76±6岁。全部为正常健康老年人。

1.2实验方法

1.2.1常规酚提取法提取外周血DNA。

1.2.2PS-1基因第5外显子体外扩增见参考文献［2］。合成引物序列：上游为5′-GTGGTAATGT-GGTTGGTGAT-3′，下游为5-CCCAACCATAAG-AAGAACAG-3′。反应体积：25μl，含有模板DNA50～100 ng、0.2 mmol/L dNTP、上下游引物各0.2 μmol/L、50 mmol KCl、1.5 mmol MgCl₂、10 mmol Tris-HCl，pH8.3、1U Taq DNA聚合酶。PCR反应条件：95℃预变性5分钟，然后按94℃30秒、58℃45秒、72℃30秒，35个循环，最后72℃10分钟。反应结束后，取PCR产物5μl，加1μl上样缓冲液，于质量浓度为0.012的琼脂糖凝胶电泳，溴乙锭染色，在紫外分析仪上检测PCR扩增产物的特异性。用100 bpDNA Ladder作marker测PCR产物片段大小，外显子5扩增长度为260bp(图1)。

图1PS-1第5外显子PCR产物电泳图M：分子量标准;a、b、c:PCR产物

fig 1PCR products of Exon 5 of presenilin-1M：marker; a,b and c:PCR products

1.2.3SSCP分析取PCR产物8μl加上样缓冲液(体积分数为0.9的去离子甲酰胺、质量浓度为0.0005的溴酚蓝、质量浓度为0.0005的二甲苯睛蓝)等量，97℃变性10分钟，骤冷，10分钟后上样于质量浓度为0.1聚丙烯酰胺凝胶(丙烯酰胺∶甲叉双丙烯酰胺为29∶1)电泳，200V恒压，20mA电流条件下电泳24小时。银染。观察变性后的二条单链电泳迁移率，比较AD患者和正常对照者有无不同。

1.2.4DNA序列分析采用ABI PRISM 310全自动基因分析仪分别对正常对照者、SSCP泳动异常及无SSCP泳动变位的AD患者的PCR产物直接进行DNA序列分析。

2结果

SSCP结果分析发现，68例SAD患者中，有4例患者SSCP显示一条单链，另有11例患者表现为一条单链增快，提示在这些患者的PS-1基因第5外显子上可能存在某一共同的突变点(图2)。

图2PCR-SSCP结果M：分子量标准;a：正常人；b、d、e、f、g、h：发生突变的AD患者；c：未发生突变的AD患者

fig 2The result of PCR-SSCPM:marker; a:normal;b,d,e,f,g and h:mutations in patients with AD; c:no mutations in patients with AD

用基因分析仪分别对SSCP泳动异常、无SSCP泳动变位的SAD患者及正常人的PCR产物进行DNA序列分析发现：4例SAD患者的130号密码子发生了CTG→ATG突变(388位点发生C→A突变)，使氨基酸由亮氨酸变为蛋氨酸(Leu130Met)；157号密码子发生了GTG→CTG错义突变(469位点发生G→C突变)，使氨基酸由缬氨酸变为亮氨酸(Val157 leu)。另11例SAD患者的130号密码子发生了CTG→ATG突变(388位点发生C→A突变)，使氨基酸由亮氨酸变为蛋氨酸(Leu130Met)；154号密码子发生了TGC-TGT突变(462位点发生C→T突变)，但未改变氨基酸的序列，为同义突变。在其他SAD患者和正常对照者中SSCP电泳均显示二条单链，无泳动异常。DNA序列分析结果见图3～6。

图3正常人a PS-1第5外显子DNA测序结果(从正向测序)

fig 3Sequencing results of exon 5 of presenilin-1 in normal a

图4发生突变的AD患者b PS-1第5外显子DNA测序结果(从反向测序)

fig 4Sequencing results of exon 5 of presenilin-1 in mutational patient b with AD

图5发生突变的AD患者g PS-1第5外显子DNA测序结果(从反向测序)

fig 5Sequencing results of exon 5 of presenilin-1 in mutational patient g with AD