摘要：生物染色体亚端粒区域在物种进化过程中是高度活跃的。为了认识水稻染色体亚端粒区 域的组织结构，用水稻第六染色体长臂亚端粒区的RFLP标记G342和R1167作探针筛选BAC文库，以得到的阳性BAC克隆为起点进行染色体步行，构建了覆盖这2个分子标记区域约500kb的BAC跨叠克隆群，将这一区域的遗传图和物理图进行了整合。对14个BAC克隆插入末端进行了亚克隆，鉴定的7个亚克隆末端为单拷贝或低拷贝序列，其中5个定位于G342和R1167的侧翼区域。用覆盖这一区域的BAC插入片段作探针对cDNA文库进行初步筛选，获得4个不同的阳性cDNA克隆。

中图分类号：Q75文献标识码：A文章编号：0379-4172（2000）05-0400-09

Integration of the Genetic Map and the Physical Map of the Subterminal Region on the Longer Arm of Rice Chromosome 6

WANG WenMingZHAI WenXueCHEN ChunXianZHENG XianWuLI XiaoBingZHU LiHuang

(Institute of Genetics, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China)

YAN ChangJie

(Agronomical College, Yang zhou University, Yangzhou 225009, China)

Abstract: The region between RFLP markers G342 and R1167 was the subterminal part of the longer arm on the rice chromosome 6, because Shen et al. (1998) mappedtwo telomeric repeat associated sequences distal to G342. In order to integrate the genetic map and the physical map of the region, G342 and R1167 were firstly used to screen BAC library. Based on the positive clones detected by the two markers and chromosome walking by using the outer most insert-end of the overlapping clones, a contig containing 16 BAC clones which spanned 500kb was constructed. All the insert杄nds of the BAC clones could be amplified with thermal asymmetric interlaced PCR. Fourteen insert-ends were subcloned. Seven of them were identified as a single or low copy sequences and five were mapped on the expected sites flanking G342 or R1167. The insert fragment isolated from the minimum tile BAC clones of the contig was used to screen a cDNA library and four different positive clones were detected.

Key words: rice; molecular marker; bacterial artificial chromosome; contig; insert end

水稻不仅是全世界主要的粮食作物之一，而且 因其具有基因组小、易于转化、遗传资源丰富等特 点而成为单子叶植物基因组研究的模式植物。Kurata等^［1］利用YAC文库构建了水稻基因组的物理图谱，但在第六染色体长臂的物理图谱仅覆盖至分子标记R1608，位于该标记靠端侧的G342至染色体端部为一大的空白区；而其他以BAC文库为基础的物理图谱^［2～4］也未达到这一区域。本实验室的Shen等^［5］曾将两个端粒标记定位于G342侧翼，陈纯贤等也在比较作图中，将与小麦抗白粉病基因Pm20相关的分子标记Xpsr148定位于这一区域（据本实验室未发表资料，图1）。因此，这一区域的遗传图和物理图的整合，不仅有利于分析、克隆这一区域的基因，而且可以帮助我们进一步研究水稻中该区域与小麦基因组的关系。基于上述考虑，我们利用RFLP标记G342和R1167作探针，筛选 BAC文库，以得到的阳性BAC克隆为基础进行染色体步行，构建了覆盖RFLP标记G342和R1167区域的跨叠克隆群（contig），将遗传图和物理图进行了整合，并获得4个不同的cDNA克隆。

图1水稻第六染色体长臂亚端粒区的局决遗传图（A）和物理图(B)

体字表示本研究使用的分子标记,细横线下的数据表示图距(cM);粗横线表示BAC克隆.图A下B间的斜线表示物理图谱与遗传图谱的对应区域.美国的图谱引自Causse等^[10],日本的图谱引自Harushima等^[9]

Fig.1 Agenetic map(A) and its corresponding physical map(B)on the subterminal regionof the longer armof rice chromosome 6

Markers in bold letters indicate those used in the present experiment .Numbers under the thin line are map distance in centimorgans (Kosambi function).Thick lines stand for BAC clones.Lines between A and B shows the corresponding sites in the genetic map and the physical map.The partial genetic maps from those constructed by Causse et al.(1994)and harushima et al,(1998)are also listed for referance

1 材料和方法

1.1 实验材料

研究中使用的2个水稻BAC文库的高密度膜及有关BAC克隆分别由菲律宾国际水稻研究所Yang等和美国Clemson大学Rod Wing等提供。窄叶青8号和京系17的加倍单倍体（DH）群体用于BAC插入末端的定位。

1.2 BAC文库的筛选

菌落杂交、阳性克隆的鉴定均按Yang等^［3］的方法。

1.3 BAC插入末端的分离与亚克隆

用TAIL朠CR法^［6］扩增BAC的2个末端，用Advantage PCR朠ure Kit （Clontech, USA）回收符 合要求的扩增片段，克隆到pGEM T easy载体中。分离BAC正向末端（F末端）的特异引物为：

BF1： 5′-ACGTTGTAAAACGACGGCCAGT-3′；

BF2： 5′-TAATACGACTCACTATAGGGCGA-3′；

BF3： 5′-AGTCGACCTGCAGGCATGCA-3′。

分离BAC反向末端（R末端）的特异引物为：

BR1： 5′-TTCCGGCTCGTATGTTGTTGGG-3′；

BR2： 5′-AGCGGATAAACAATTTCACACAGGA-3′；

BR3： 5′-GGTGACACTATAGAATACTCA-3′。

按Liu等^［6,7］的报道，分别合成并使用了6个任意简并引物，即：

AD1： 5′-GAGNAGTANCAGAGA-3′；

AD2： 5′-GTGNAGAANCAAAGG-3′；

AD3：5′-ATCGNCNGANACGAA-3′；

AD4： 5′-CGTNCGNACNTAGGA-3′；

AD5： 5′-TCGA（G／C）T（A／T）T（G／C）G（A／T）GTT-3′；

AD6： 5′-GTCGA（G／C）（A／T）GANA（A／T）GAA-3′。

1.4 跨叠克隆的排列与染色体步行

用HindⅢ酶切BAC克隆，根据酶切模式排定跨叠克隆间的关系，用分离的BAC末端作探针进行Southern杂交验证。以位于contig最外测的2个末端作探针筛选BAC文库，得到的阳性克隆经末端分析验证并整合到contig中。染色体步行的方向通过BAC末端亚克隆在用窄叶青8号／京系17的DH群体构建的遗传图谱上的定位来确定。构建的contig覆盖长度通过测定BAC克隆的重叠程度和 插入片段的大小来确定。BAC克隆的重叠程度及插入大小通过比较BAC克隆的HindⅢ酶切和NotⅠ酶切检测。脉冲电泳（PFGE）条件：用1% Agarose朙E 凝胶，在0.5×TBE的缓冲液中，以6 V／cm 的电压、120度电泳角度、0.22～6.80s的脉冲时间，14℃下电泳15h。

1.5 cDNA文库的筛选

用NotⅠ酶切BAC克隆，回收插入片段作探针，按标准的方法^［8］筛选1个已建成的水稻cDNA文库（中国水稻研究所钱前博士提供）。

2 结果

2.1 RFLP标记G342和R1167的阳性克隆筛选

RFLP标记G342和R1167是日本Harushima等^［9］构建的水稻遗传图谱上的分子标记，RG433是美国Causse等^［10］构建的遗传图谱上的分子标记。本实验室在用南京11／巴里拉的DH群体构建的RFLP图谱上，将RG433和G342定位于同一位点； 另外，在用窄叶青8号／京系17的DH群体构建的RFLP图谱上，对R1167的定位结果与日本的图谱相似，并将G342和RG433定位在紧密连锁的2个位点（图1，A）。分别用这3个RFLP标记作探针在BAC文库中进行筛选，其中用G342和RG433作探针得到相同的4个阳性克隆，即43G4、 43N17、 45E6和14D21。这一结果进一步说明RG433和G342两个分子标记是紧密连锁的，物理距离不会超过这4个克隆间相互重叠的片段长度（约50kb）。用R1167对BAC文库进行筛选，也获得4个阳性克隆，即36P18、 20P22、 38M6和38N7（表1）。根据HindⅢ酶切模式对这些克隆进行排列及杂交分析，发现前4个克隆和后4个克隆形成2个独立的contig。

表1用RFLP标记及染色体步行鉴定的BAC克隆

Table 1 Positive BAC clones detected by RFLP markers and cloned insert-ends as markers for ch