摘要：对7号淀粉酶菌M1033的遗传背景进行分析，建立了其原生质体制备、转化的优化条件。构建了葡萄糖异构酶（GI）结构基因内插入硫链丝菌肽基因（tsr）的置换型同源重组质粒，利用其变性双链片段实现与M1033菌株染色体上基因的同源重组，获得置换型葡萄糖异构酶缺陷型菌株M1033LJ。为在染色体上引入突变位点实现染色体上分子定点改造奠定了基础。

中图分类号：Q817文献标识码：A文章编号：0379-4172（2000）05-0449-06

Glucose Isomerase Gene Knock-out by Denatured

Double-stranded DNA

LIAO JunXU ChongYANG YongHuiLI HuiCHENG YangCHEN ChengLuZHU GuoPingYuZhen

(Department of Cell and Molecular Biology, School of Life Sciences, University of Science and Technology of China, Hefei 230027, China)

NIU LiWenWANG

(The Key Lab of Structure Biology, University of Science and Technology of China, Hefei 230027, China)

Abstract: After Genetic background analysis of Streptomyces diastaticus No.7 strain M1033, the modified conditions of M1033 protoplasts and transformation were established. Replacement plasmid for homologous recombination was also constructed by inserting tsr gene into glucose isomerase gene. The homologous recombination of GI gene in M1033 chromosomes was achieved by using denatured linearized DNA fragments and glucose isomerase deficient strain M1033LJ was obtained. It is basic for introducing mutation into M1033 chromosome and realizing site-directed molecular reformation. -directed molecular reformation.

Key words: glucose isomerase; Streptomyces; homologous recombination

7号淀粉酶链霉菌M1033菌株所产葡萄糖异构酶^［1］（Streptomyces diastations No.7 strain M1033 glucose isomerase, 简称GI）可以催化D-葡萄糖到D-果糖的异构化反应，是工业上大规模制备高果糖浆的关键酶。八^。五期间我们依据1.9埃分辨率野生型GI晶体结构模型和分子模拟设计，构建并获得了一系列GI突变体^［2～4］。其中双突变体酶GI（G138P.G247D）在酶活和热稳定性上改造极为成功（专利受理号：97119714.8）。考虑到葡萄糖异构酶突变体规模化工业生产时链霉菌中质粒表达系统的不稳定性和序列丢失现象^［5］，我们希望通过基因敲除、基因置换的两步同源重组方法，将双突变位点引入M1033染色体GI基因内，构建一稳定高效表达可用于工业生产的链霉菌基因工程菌株。本文报道了以一种新方法即变性双链法进行同源重组实现M1033中葡萄糖异构酶基因敲除的研究工作。

1 材料和方法

1.1 菌株与质粒7号淀粉酶链霉菌M1033、大肠杆菌NM522均为本实验室贮藏。含双突变GI基因的重组质粒pUB₁-GI₂，为本课题组构建。链霉菌质粒pIJ702为中国科学院微生物所谭华荣教授惠赠。

1.2酶及主要试剂限制性内切酶XhoⅠ、BclⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ、SalⅠ、T4 DNA连接酶、DNA聚合Ⅰ酶 Klenow大片段均为华美生物工程公司产品。DIG DNA Labelling and Detection Kit为Boehringer Mannkeim产品。Sephaglass BandPrep为Pharmacia公司产品。

1.3 培养基及抗生素大肠杆菌用LB培养基，按文献［6］方法配制；链酶菌用YEME液体培养基和R₂YE固体培养基按文献［6］配制。硫链丝菌肽（Thio）溶于二甲亚砜中，贮存浓度为50mg／ml。使用浓度在固体培养基中为50μg／ml，在液体培养基中为5μg／ml。

1.4 引物的设计和PCR根据GI结构基因编码序列，分别设计了5′端和3′端PCR引物。

P1：5′?AAACATATGAGC TAC CAGCCC ACC CCC GAG-3′ （30mer）

P2：3′朅AAGGATCCCTA GCC CCGCGC GCC CAG CAG-3′ （30mer）

聚合酶链式反应按华美生物工程公司的扩增系统C说明书进行，在其反应体系中添加10% DMSO。

1.5大肠杆菌质粒的纯化、酶切、回收、连接及转化按文献［6］方法进行。

1.6链霉菌质粒、总DNA的纯化；原生质体制备、转化按文献［6］方法进行。

1.7葡萄糖异构酶活力的测定以D-葡萄糖或D-木糖为底物,采用改进的乙醇-咔唑法^［7］。

1.8Dot blot与Southern杂交分析按Boehringer Mannheim公司的DIG DNA Labelling and Detection Kit说明书操作。探针为GI基因上1.2kb的Sph DNA片段。

1.9变性双链DNA的制备采用碱变性法：9l双链DNA溶液中加入2l 1mol／L NaOH 37℃温育10min，然后迅速置于冰上冷却，再加入2μl 1mol／L HCl中和，即可直接用于转化。

1.10 Western杂交分析以实验室分离纯化的电泳纯葡萄糖异构酶作为抗原，注射家兔。2次加强免疫后，提取兔血清为抗体，作为Western杂交的一抗（稀释倍数为1200）。二抗为华美生物工程公司生产的HRP偶联的羊抗兔抗体（稀释倍数为1250）。Western杂交方法参考文献^［8］进行。

2结果

2.1 M1033菌株原生质体制备及转化条件的建立M1033作为同源重组的宿主菌必须建立完善的DNA导入条件。由于M1033是经过诱变得到的高产葡萄糖异构酶的嗜热菌，可能难于制备原生质体。我们首先尝试利用电转化的方法导入质粒，希望能缩短实验周期，但转化产率极低。后采用经典的溶菌酶法制备M1033原生质体，PEG导入外源DNA，转化频率有所提高，但仍不理想。再对菌体生长时间、溶菌酶浓度、作用时间等条件进行优化后，使转化频率提高至104～105／μg DNA。

2.2 置换型同源重组质粒pTR的构建pUB₁～GI₂质粒含有完整的GI结构基因、启动子及3′端非调控序列。首先用Xho酶切pUB₁，Klenow补平后回收4.9kb的大片段待用。同时用BclⅠ酶切pIJ702，补平后电泳回收1.1kb的tsr基因片段；双平端连接得到重组质粒pTR。重组质粒中GI结构基因第700位至3′端后第400位被tsr基因替代。插入的tsr基因一方面将GI结构基因打断，一方面作为同源重组后重组菌株的选择性标记（图1）。

图1重组质粒pTR的构建

Fig.1 Construction of recombinant plasmid pTR

2.3变性双链法实现同源重组分别采取pTR的EcoRⅠ-HindⅡ片段的碱变性和非变性形式作为同源重组单元，转化M1033原生质体。硫链丝菌素抗性筛选转化子。结果显示采取变性双链法获得抗性转化子的转化频率为101～102／μg DNA，而采取非变性双链未获得转化子。通过摇瓶测活检测转化子的酶活，发现了一个GI活性丧失的菌株M1033LJ。蛋白电泳与Western blotting进一步证实了活性检测的结果（图2，图3），即在M1033LJ中已不表达43kD的GI蛋白。以GI基因的Sph片段作为标记探针，与Sal酶切的M1033LJ及M1033染色体杂交发现，M1033LJ染色体上原GI基因已与我们的重组单元进行了双置换。由于置换的tsr基因使GI基因内多了一个Sal位点，M1033LJ显示为1条1.2kb的杂交带，而M1033为1条3.2kb杂交带（图4，图5）。同时对M1033LJ及M1033染色体用P1、P2引物进行PCR扩增，亦得到预期的结果（结果未显示）。据此可以证明我们已成功地利用双置换同源重组实现了M1033染色体中GI基因的敲除（图6）。

图2SDS-PAGE结果

1.蛋白分子量标准;2.葡萄糖异构酶纯酶;3.M1033胞内粗酶液;4.M1033Lj胞内粗酶液

Fig.2 Results of SDS-PAGE

1.Protein molecular weight standard;2.Purified GI;3.Crude extracts from M1033;4.Crude extracts from M1033Lj

图3Western杂交结果

1..M1033Lj胞内粗酶液;2..M1033胞内粗酶液;3.葡萄糖异构酶纯酶

Fig.3 Results of Western-blot

1.Crude extracts from M1033Lj;2.Crude extracts from M1033;3.Purified GI

图4Dot blot结果