摘要：肥胖基因（ob）是近年刚被克隆的新基因，该基因产物Leptin是反映体内脂肪含量和调节体重的重要信号因子。首次报道猪ob基因全长序列，并对不同物种ob基因的同源性进行了比较。以 Uni朲APTM为载体构建了猪脂肪cDNA文库，根据已知的人和鼠ob基因序列设计PCR引物，利用PCR法筛选猪脂肪cDNA文库，并用RT－CR从脂肪RNA中扩增的366bp猪ob基因片段作探针，获得了全长3 277bp的猪ob基因cDNA的克隆和序列。ob基因序列在不同的物种之间具有很强的保守性。猪与人和鼠ob基因编码区核苷酸序列的同源性分别为88.5%和84.7%；猪ob基因编码的Leptin蛋白氨基酸序列和人、鼠Leptin蛋白的同源性分别为86.0%和83.4%。RT－CR分析表明：猪ob基因不仅在脂肪组织中大量表达，而且在肝脏、心脏、脾脏、肾脏、肌肉组织中也有微量表达。表明猪ob基因的表达调控与人和鼠可能存在差异。

中图分类号：Q343 文献标识码：A 文章编号：0379-172（2000）04-0290-297

Molecular Cloning and Analysing of Porcine Obese cDNA

DAI Ru-Juan, WU Chang-Xin

(College of Animal Science and Technology, China Agricultural University, Beijing 100094, China)

LI Ning

(National Laboratories for Agrobiotechnology, China Agricultural University, Beijing 100094, China)

Abstract: Obese gene(ob)isa novel gene cloned recently. The product of ob geneLeptin is an important signal reflecting body fat mass and controlling body weight. In this study the complete nucleotide sequences of porcine ob cDNA were identified, and the homology with ob genes from other species was also compared. The porcine fat cDNA was constructed based on λUni-ZAP^TM system. The primers designed on the consensus region of human and mouse ob gene were employed to perform PCR-screening of the cDNA library, and a 366bp DNA fragment amplified from total RNA of pig fat cells was used to confirm positives as a hybridization probe. The complete ob cDNA with 3277bp in length was cloned and sequenced . The nucleotide sequences of ob genes between different species were very conservative. The overall identity of ob nucleotide sequences was 88.5% between pig and human, 84.7% between pig and mouse. The homology of ob amino acid sequences was 86.0% between pig and human. 83.4% between pig and mouse. The result of RT-PCR for transcripts detection of pig ob gene indicate that ob gene was expressed not only mainly in adipose tissue but also slightly in other tissues such as kidney, liver, spleen,heart and muscle, which imply that expression nature of pig ob gene is different from that of human and mouse ob gene.

Key words: ob gene; Leptin protein; porcine fat cDNA library

不同猪种在脂肪蓄积能力方面差异比较大，西方商业猪种大都为瘦肉型，瘦肉率基本都在55%～60%以上，而我国大部分地方猪种为脂肪型，瘦肉率只有45%～50%左右，表明我国地方猪种具有较强的脂肪蓄积能力^［1］。脂肪型和瘦肉型猪在脂肪含量上的巨大差异，虽然受环境和饲料的影响，但主要还是二者的遗传背景的差异造成的。长久以来，动物遗传育种工作者希望能找到影响猪生长和脂肪蓄积的主基因，并对一些影响脂肪合成和代谢的激素和酶的基因进行了分析，如生长激素、乙酰辅酶A等等，没有发现这些基因对脂肪蓄积具有主基因效应。

肥胖基因（Obese: ob）于1954年在小鼠中发现，为常染色体隐性遗传。1994年，小鼠和人ob基因的克隆和分析充分证明了ob／ob肥胖型小鼠的肥胖表型是由于ob基因的遗传变异而不能产生正常蛋白产物造成的。ob基因的产物“瘦蛋白”(Leptin)主要作用于大脑的摄食和饱食中枢，对体脂的蓄积进行反馈调控，对体重、体内脂肪蓄积和摄食行为有重要调节作用^［2］。科学家们利用重组的人与鼠Leptin蛋白，对肥胖型小鼠(ob／ob)进行处理，可明显改善ob／ob小鼠的肥胖表型，体重在3周内下降40%，正常小鼠的体重由于Leptin蛋白的处理也下降了12%^［3～5］。

考虑到ob基因产物可以反映体内脂肪含量信息及调节体重，我们推测猪ob基因有可能是影响猪生长和脂肪蓄积的数量性状位点，它的克隆和分析将对猪的育种和提高瘦肉生产率有重要意义。在猪的育种生产过程中，我们发现猪的瘦肉生长率的选择提高总是与饲料转换率的降低相联系，这一现象尤其在猪自由采食时更明显。解释这一现象的假设有可能是Leptin蛋白的表达和作用是被紧密连在一起调控的。猪的ob基因位点有可能是潜在的影响体脂含量、摄食量及饱食感的一个数量性状位点^［6］。另外，由于猪与人基因组序列在进化上的保守性，猪ob基因的分析使猪有可能成为研究人类肥胖病的有利动物模型，并且可以进一步分析ob基因在不同物种的表达调控机理。

目前，关于畜禽肥胖基因的报道较少，国外还没有全长畜禽ob基因序列的报道，本文克隆分析了猪肥胖基因的全长cDNA序列，并对ob在不同组织的表达分布进行了分析。

1 材料和方法

1.1 组织样从刚屠宰的猪采取各种新鲜组织样品，立即放入液氮中，采取的组织样可在－70℃长期保存。

1.2 PCR引物的设计我们选择人和鼠ob基因cDNA编码区序列的保守区，主要依据人ob基因的序列设计了两对引物，分别可从猪脂肪RNA中反转录扩增366bp和684bp的ob基因片段。引物序列如下：

obF₁ 5′ GTCACCAGGATCAATGACAT 3′ 20bp；

obR₁ 5′ CTGTCACAGCATGTCCTGCAGAG 3′ 23bp；

obF₂ 5′ AGCGATCCCAGGGAAGGAAAATG 3′ 23bp；

obR₂ 5′ GGCTTAGGGTCTTATGCCTTTGG 3′ 23bp。

1.3 RT－CR扩增条件的建立PCR仪为Gene Amp PCR System 2400, RT－CR试剂盒为Promega公司的AccessRT－CR System。反应体积为25l，含有1×AMV／Tfl buffer,dNTPs的终浓度为0.2mmol／L, 引物浓度各为1m, Mg^2＋浓度为1mmol／L，AMV反转录酶终浓度0.1U／l,Tfl DNA聚合酶0.1U／l。RNA样品0.5～1g。扩增条件为48℃反转录60min, 94℃变性3min, 1个循环；94℃变性50s, 55℃, 退火1min 30s, 68℃延伸3min，35个循环；68℃延伸7min，1个循环，4℃保存。RT－CR反应产物在2%琼脂糖凝胶上电泳分析。利用建立的RT－CR反应条件分析猪ob基因在不同组织的表达分布。

1.4 RT－CR产物的回收克隆与序列分析利用GENECLEAN II试剂盒将RT－CR产物从凝胶中回收，连接到Promega公司的pGEM朤载体上，转化DH5π感受态细胞获得重组菌落。利用ABI－77全自动序列分析仪进行测序。

1.5 猪脂肪组织cDNA文库的构建与筛选利用ISOGENE RNA提取试剂盒从脂肪组织大量制备总RNA后，立即利用Pharmacia公司的mRNA Purification kit和Stratagene公司的cDNA合成试剂盒进行mRNA的分离纯化和反转录合成cDNA。将合成的cDNA按比例连接到Stratagene公司的 Uni朲APTM XR载体上，并用包装蛋白进行包装，建立猪脂肪组织的cDNA文库。利用PCR柹缚夥ù又碇綾DNA文库中分离克隆猪ob基因^［7］。

1.6 猪ob基因cDNA的序列测定与分析通过酶切分析建立猪ob基因的酶切图谱后，对猪ob基因进行亚克隆。采用ABI公司PRISMTM Ready Reaction Dye Primer Cycle Sequencing和Ready Reaction Dye Terminate Cycle Sequencing试剂盒对亚克隆进行序列反应，通过ABI－77全自动序列分析仪进行序列分析。利用GENETYX－.5软件对测得的ob基因序列与人、鼠序列进行同源性比较分析。

2 结果

2.1 RT－CR分析ob基因在猪不同组织的表达分布利用引物obF₁, obR₁分析了ob基因在脂肪、肝脏、脾脏、心脏、肾脏、肌肉组织中的表达情况。

从图1我们可以看出猪ob基因在脂肪组织中大量表达，明显高于其他组织。但我们也意外发现猪ob基因在检测的其他组织也有微量的表达，这与在人和鼠中的研究报道有极大差异。虽然目前有人在人胎盘细胞中也检测到了ob基因的表达，但ob基因主要在人和鼠的脂肪组织中表达，而在其他大多数组织，如我们实验中所检测的几种组织，不论用Northern杂交还是RT－CR均不能检测到该基因转录物的存在^{［2，8，9］}。这说明猪ob基因的表达分布及其调控机制与人和鼠存在差异。

图1RT-PCR分析猪ob基因在猪不同组织的表达分布