摘要：为了进一步揭示蛋白质的耐热机制，对含有耐热碱性磷酸酯酶（FD-TAP）的表达质粒pTAP503F进行了随机诱变，用菌落原位显色法从约5000个转化子中筛选到4个耐热性下降的突变型克隆，并对其中1个克隆（TAPM3）进行了部分酶学性质、DNA和氨基酸序列的研究。酶学性质研究表明，与野生型相比，该突变型酶的耐热性有较大幅度的下降，而热激活性无明显改变。DNA序列分析表明在1 239位TAPM3发生GA转换，导致427位的甘氨酸变为丝氨酸（G427S），这种突变对酶的耐热性、米氏常数、活化能影响较为明显。这说明只须1个氨基酸置换就会对蛋白质耐热性变化起巨大作用，并且氨基酸残基侧链的大小、电荷等能使蛋白质结构松散的性质，会导致蛋白质耐热性下降。

中图分类号：Q319 文献标识码：A 文章编号：0379-172（2000）04-361-368

A Study of a Mutant of Thermostable Alkaline Phosphatase

YUAN You-Zhong, ZHAO Si-Hui, ZHOU Zong-Xiang,

JI Chao-Neng, SHENG Xiao-Yu, MAO Yu-Min

(Institute of Genetics, State Key Laboratory of Genetic Engineering, Fudan University, Shanghai 200433, China)

Abstract: To reveal the mechanism of protein thermostability, we used in vivo random mutagenesis to generate variants of pTAP503F which contained thermostable alkaline phosphatase (FD-TAP). After screening about 5 000 clones, we obtained 4 temperature-sensitive mutants. The study of enzymatic properties of one mutant (TAPM3) showed that the thermostability of the mutant enzyme descended a lot, compared to the wild type, while the thermoactivity remained stable. DNA sequencing showed that the G-A transition in position 1239 resulted in the substitution from glysine to serine in position 427. This mutation conspicuously affected thermostability, Michaelis constant and energy of activation. This suggests that only one substitution of amino acid will make great changes in thermostability and other properties, meanwhile, side-chain size, charge of residues and so on, which loosen the structure of protein, will result in the descent of thermostability.

Key words: thermostable alkaline phosphatase; random mutagenesis; substitution ofamino acid

近几年，来自嗜热细菌的耐热蛋白酶的研究吸引了众多研究者，这主要基于以下两个原因：一是这些工作将有助于人们对蛋白质耐热机制的了解，从而为蛋白质的改造奠定良好基础；二是耐热蛋白酶的许多理化性质，尤其是在极端条件下所具有的生物活性，在各种生物技术过程中有着广泛的应用前景。

目前蛋白质耐热性的研究方法主要有两种，一是对来源于嗜温和嗜热细菌同源蛋白进行一级和高级结构的比较，如Merkler提出蛋白质疏水性指数，Ikai提出脂肪族氨基酸指数^［1］等。但由于没有考虑二、三级结构因素，这些分析结果的意义比较局限；二是应用蛋白质工程如氨基酸定点或随机突变及基因拼接技术探讨哪些氨基酸的置换或亚结构的相互作用与蛋白质耐热性有关，从而找出一些基本规律。当前国际上主要采用的突变方法是定点突变，其缺点是一方面该法对具有三维结构数据的酶更有用，另一方面由于酶分子可改变的位置很多，限于力量一般只能在少数位置进行研究。 而随机诱变一次可产生大量不同的突变体，在筛选到足够多突变体的情况下可能提供更多信息。更重要的是随机诱变的不确定性使突变的种类很多，这就有可能不局限于前人的经验而发现一些新规律。目前对耐热蛋白随机诱变后进行大规模研究的报道还较少见。

本室已从1株栖热菌（Thermus sp. FD3041）中克隆了其耐热碱性磷酸酯酶（Thermo－stable alkaline phosphatase，简称FD-TAP）基因，测定了该基因的序列并构建了能在E. coli中表达的质粒^［2～5］。它产生的FD-TAP在95℃保温60min后仍保留75%的活力，同时由于检测碱性磷酸酯酶活性方法简便，因此是研究蛋白质耐热性的极好材料。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和质粒 E. coli TG1 {supE hsd5 thi D(lac杙roAB) F ［traD36 proAB＋ lacIq lacZDM15］}, E.coli Mph44{F′［araD139 Τ(ara杔eu)7697 Τlac－4 galU galK rpsL Τ(phoA杙roC) phoR tsxTn5］}为本室保存。克隆有FD-TAP基因的表达质粒pTAP503F为本室构建。

1.1.2 培养基 LB固、液体培养基，2×YT液体培养基：1.6%蛋白胨，1%酵母粉，0.5%氯化钠，pH7.0。

1.1.3 试剂 聚乙烯亚胺（PEI），核酸结合剂，用于沉淀核酸和蛋白。CM-Sepharose FastFlow及Wizard plus mini preparation Kit购自Pharmacia Biotech公司，对硝基苯磷酸盐（pNPP）购自Merck公司，亚硝基胍（MNNG）购自Sigma公司，其他试剂均为国产分析纯。

1.2 实验方法

1.2.1 DNA样品制备 质粒双链DNA小批量快速制备按文献^［6］进行，大量制备时在此基础上以13%（W／V）PEG－000，1.6mol／L NaCl沉淀。

1.2.2 随机诱变方法 按Kironde的方法^［7］略加改进。表达质粒pTAP503F转化E.coliITG后，30℃培养过夜。过夜菌按1100接种至200ml含Amp的LB中30℃培养至OD＝0.6，收集菌体悬浮于6ml磷酸缓冲液（100mmol／L，pH6.0）中。1ml菌液作对照，另5ml加入MNNG（先用甲酰胺溶解）至终浓度为100g／ml，30℃轻摇温育，于7.5、15、30、60和120min各取出1ml，分别用10ml磷酸缓冲液洗3次，加入到200ml LB中培养2.5h，离心收集菌体，抽提质粒备用。

1.2.3 突变型的筛选 用菌落原位显色法筛选，参见文献^［2］。

1.2.4 FD-TAP蛋白的分离纯化 （1）细胞破碎及酶的初步处理：将10g湿菌体悬浮于100ml 50mmol／L Tris-HCl、 pH8.8、5%甘油缓冲液中，冰浴中超声破碎，离心后加入PEI去除核酸， 再经离心后上清中逐步加入固体硫酸铵达60%饱和度， 0℃搅拌1h。沉淀用1／8体积的Buffer A［10mmol／L K₂HPO₄-H₂PO₄ (pH6.5), 5%甘油］溶解，4℃下对相同的缓冲液透析除盐。（2）CM-Sepharose Fast Flow柱层析：经透析除盐后的蛋白上CM－Sepharose Fast Flow柱，用NaCl(0～800mmol／L)进行线性梯度洗脱，分管收集酶活峰，SDS-PAGE电泳分析蛋白质的纯度后合并纯蛋白，用Buffer A透析，4℃保存备用。

1.2.5 SDS-PAGE电泳 选用Laemmli的高pH不连续缓冲体系，分离胶浓度8%，浓缩胶浓度为5%。

1.2.6 耐热碱性磷酸酯酶的活性测定 参见文献^［2］。

1.2.7 热稳定性测定 等量的待测酶液在不同的温度保温10min后，置于冰上10min，在70℃测定残留酶活。

1.2.8 最适温度测定 等量的反应缓冲液先在不同的温度保温10min，然后按耐热碱性磷酸酯酶的活性测定方法于不同温度测定酶活。

2 结果

2.1突变型的筛选和鉴定

通过前述原位显色的方法，我们从约5 000个经诱变的E. coli TG1／pTAP503F菌落中初步筛选到25个无色菌落，抽提质粒后转化E. coli Mph44，将菌落直接于65℃显色，结果有13个菌落不显黄色，在25℃下仍测不出任何活性，表明是FD-TAP完全失活或不能表达的突变型。 其余12个菌株分别接种于20ml 2×YT中，30℃培养2～3h后于42℃诱导培养10h，收集菌体，用50mmol／L Tris-HCl (pH8.8)悬浮后超声破菌后离心取上清。将这些粗酶液分别于80、85、90、95℃保温10min，在65℃测定剩余酶活力，有8个菌株酶活力的变化与野生型相同。这些菌株有两种可能：一是突变导致了酶的表达量下降或酶的比活下降而产生的假阳性；二是突变型酶在高温下对SDS的耐受性下降，因为在破菌缓冲液中含有SDS。 最终我们确定的温度敏感突变型为4个，记为“TAPM1～4”。

2.2 突变型酶的分离纯化

含有突变TAP质粒的大肠杆菌Mph44发酵后，按材料和方法1.2.4处理，经过细胞破碎，酶的初步分离，CM-Sepharose Fast Flow柱层析和透析等步骤，得到高纯度的突变耐热碱性磷酸酯酶（图1），4℃保存备用。

图1TAPM3突变型酶的SDS-PAGE电泳图谱

A.破菌液;B.PEI沉淀;C.(NH₄)₂SO₄沉淀;D.柱层析;E.分子量标记

Fig.1 SDS-PAGE of mutant TAPM3

A.Crude extract;B.PEI treatment;C.(NH₄)₂SO₄ treatment ;D.Column chromography;E.Molecular weight marker

2.3 突变型酶部分酶学性质的研究