摘要：选择汕优63 F₂的高可育株和高不育株分别建立2个基因池，利用AFLP标记技术对2池间的多态性进行了研究。分析表明，64组引物在两池间全部扩增出了稳定、清晰的带纹，共计3477条带。多数引物在基因池间未呈现多态性，只有引物组合E-AGC／M-CAA在基因池间表现多态性，用双亲、F₁、F₂单株以及生产和育种上的骨干不育系与恢复系验证均表明这组引物所揭示的多态性片段与恢复基因有关（命名为AP₁）。AP₁为单拷贝，与恢复基因间的距离为4.76cM。

中图分类号：Q343.1^＋7 文献标识码：A 文章编号：0379-172（2000）04-304-310

AFLP Markers of Restoring Genes of the Wild-Abortive Hybrid Rice

HE Guang-Hua, PEI Yan, YANG Guang-Wei, TANG Mei,HOU Lei

(Center of Biotechnology, Southwest Agricultural University, Chongqing 400716, China)

HE Guang-Hua,XIE Rong, YANG Zheng-Lin, LI Yong-Hong

(Rice and Sorghum Research Institute, Sichuan Academy of Agricultural Sciences, Luzhou 646100, China)

Abstract: Fertile and sterile pools were set up by bulked segregant analysis (BSA) based on the selection for the highly fertile and highly sterile plants of Shanyou 63 F2population The AFLP analysis of the two pools indicated that 64 primer combinations amplified 3 477 stable and clear bands. Exception of the combination E-AGC／M-CAA,all primer combinations had not detected polymorphism between the two pools. It was proved by investigation of two parents, individuals of F2 segregant population, backbone sterile lines and restorer lines that the polymorphic fragment AP1 generated from the primer E-AGC／M-CAA was associated with the restoring gene. AP1 was a single copy detected by Southern blot hybridization. The distance between AP1 and the restoring gene was 4.76cM.

Key words: wild-abortive; hybrid rice; restoring gene; AFLP marker

植物雄性不育一般分为“细胞核不育”、“细胞质不育”和“质核互作不育”3种类型，目前在生产上大面积使用的是“质核互作不育”类型（如水稻、玉米等）。我国1973年在世界上首次成功地实现了杂交水稻“三系”配套，并在生产上得到了广泛应用，已累计推广近2亿公顷，为我国乃至世界的粮食增产作出了巨大贡献。其中野败型不育胞质使用最多、推广面积最大，占总面积的90%以上。杂交水稻能应用的关键之一就是要求F1具有高的结实率，这一特性是由恢复系所具有的恢复基因决定的。由于它在“三系”杂种优势利用中具有极其重要的地位，其研究历来受到广泛关注^［1］。

随着分子标记技术的出现和发展，由于分子标记技术所具有的显著优越性，可对恢复基因进行深入研究。已有一些学者利用RAPD、RFLP等技术在这一领域开展了研究^［2～5］，但未得出统一结论。分子标记技术的发展非常迅速，自1980年RFLP提出以来，已先后有20多种技术出现。但1993 Zebeau和Vos^［6］发展起来的扩增片段长度多态性（AFLP）技术被认为是一种有效的分子标记，既有RFLP的可靠性，又有RAPD的方便性^［7］。因此，本研究采用该技术对野败型恢复基因的分子标记进行研究。

1 材料和方法

1.1 基础群体的构建

1996年夏在泸州配制珍汕97A/明恢63（汕优63），同年秋海南繁殖F1，并对F1进行单株套袋，成熟时单株收获F1种子。1997年种植F2，苗期剪取幼嫩叶片提取DNA，成熟时分别考查各株结实率。由于汕优63 F2细胞质来源于珍汕97A，全部F2单株均含有不育胞质，凡是结实正常的植株均含有恢复基因、不育株均不含恢复基因，据此建立以下基因池群体：选取高结实的15个单株等量混合DNA构成可育池，简称F池；选取高不育的15个单株等量混合DNA构成不育池，简称S池。

1.2 实验方法

1.2.1 DNA的提取与纯化叶片DNA的提取参照McCouch^［8］的方法进行。

1.2.2 AFLP分析首先分别对基因池进行AFLP分析，然后根据实验结果进行验证。AFLP分析参照AFLPTM试剂盒（Instruction manual，1997）说明书进行。采用了8个E端引物（AAC，AAG，ACA，ACC，ACG，ACT，AGC，AGG）和8个M端引物（CAA，CAC，CAG，CAT，CTA，CTC，CTG，CTT），构成64组引物对。

酶切基因组DNA：25μl反应体系中含有超纯水14μl, 5×reaction buffer 5l, Sample DNA 4l（含DNA约0.2μg），内切酶EcoRI和MseI 2μl（各3U），混匀，用封口膜封口后于37℃酶切2h, 70℃ 15min灭活酶。

人工接头连接：在酶切后的DNA中，于冰上加入人工接头24μl、T4 DNA连接酶1μl，缓慢混匀，置于20℃保温2h，即得到AFLP中PCR反应的模板DNA。

预扩增：25μl反应体系中含预扩增Mix 20μl, PCR buffer for AFLP 2.5μl, Taq DNA聚合酶1U，模板DNA 2.5μl。预扩增时EcoRI端将A作为选择扩增碱基，Mse端将C作为选择扩增碱基。反应扩增条件为：94℃ 30s, 56℃ 1min, 72℃ 1min, 20个循环。

标记引物：10μl反应体系中含一种E端引物3.6μl, 5×T4 Kinase buffer 2μl,［γ－³²P］ATP 1.5μl, ddH2O 2.4μl, T4 Kinase 0.5μl。37℃反应1h，70℃温浴10min。

选择性扩增：20μl反应体系中含有标记的E端引物4.5μl, AFLP杇rade water 12.5μl,10×PCR buffer for AFLP 2μl, Taq DNA聚合酶1l(1U／l)。在EcoR端和Mse端分别选用2个碱基作为选择扩增碱基。扩增条件为：94℃ 30s, 65℃ 30s, 72℃ 1min, 1个循环；94℃ 30s, 65℃～56℃ 30s（每个循环温度下降约0.7℃), 72℃ 1min, 12个循环；94℃ 30s, 56℃ 30s, 72℃ 1min, 23个循环。

扩增产物用6%的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳：凝胶置－70℃放射自显影2～7d后，观察结果并摄影。

1.2.3 特征片段的回收纯化 在放射自显影时，将X光片与凝胶对齐，并作好标记。显影后再对齐，用干净刀片在特征片段位置将凝胶回收入1.5ml管中，加入1ml TE, 15min后，倾出TE，再加入1ml TE（内含100mmol／L NaCl），煮沸10min。室温下冷却过夜，即得纯化DNA，置于4℃备用。

1.2.4 Southern杂交 用地高辛标记探针，真空转移DNA，Southern杂交参照《分子克隆实验指南》进行。

2 结果与分析

2.1 明恢63与珍汕97A间的多态性

采用15对E端与M端引物组合分析了明恢63与珍汕97A间的多态性，结果表明，AFLP扩增带纹非常稳定、清晰，15对引物共扩增出了815条带，平均每个引物扩增54.33条带，289条表现为多态性，多态性频率为35.46%。说明AFLP技术可以用于本实验研究。

2.2 与恢复基因相关的分子标记筛选

由于15组引物中每组引物均能在双亲间扩增出多态性，因此我们首先在基因池间寻找多态性，采用了64组引物对基因池进行筛选。结果所有的引物都能稳定扩增出清晰带纹，一般能扩增出50～100条带，64组引物共计扩增出了3 477条带，经过反复验证，多数引物在基因池间不存在多态性差异，只有引物E-AGC／MC-AA在基因池间稳定扩增出差异带，可育池比不育池多1条带（图1），命名为AP1。由于两基因池间除恢复性存在差异外，其他性状无差异，因此推测该差异片段可能与恢复基因有关。为了确证该片段是否与恢复基因连锁，我们进行了以下验证。

图1基因池、亲本、F₁的多态性

（引物为E-AGC/M-CAA）

F：可育池；S：不育池；P₁：明恢63；P₂：珍97A；F₁：汕优63

Fig.1 AFLP patterns amplified with primers E-AGC/M-CAA of the fertile and sterile pools ,the parents Minhui 63 and Zhenshan 97A,F₁ hybrids Shanyou 63.The polymorphic DNA fragment AP₁ putatively associating with the restoring gene is indicated by arrow

F:Fertile pools; S:Sterile pools; P₁:Minghui 63; P₂:Zhenshan 97A; F₁:Shanyou 63

2.3 特征片段验证

2.3.1 筛选片段的双亲验证 明恢63细胞核具有恢复基因，而珍汕97A含不育基因，理论上两者在特征片段位置上应存在差异。用上述筛选的引物E-AGC／MC-AA对珍汕97A、明恢63进行了验证，结果能在珍汕97A和明恢63间同一位置表现出差异，明恢63具有特征带，而珍汕97A无。说明该