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中图分类号：Q813 文献标识码：A 文章编号：0379-172（2000）04-331-337
Regeneration of HNP Transgenic Alfalfa Plants by Agrobacterium
Mediated Gene Transfer
LÜ De-Yang, TANG Shun-Xue,HOU Ning, WANG Qing
(Institute of Genetics, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China)
FAN Yun-Liu, YU Mei-Min
(Biotechnology Research Centre, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China)
Abstract: Transgenic plants regenerated from cotyledons of M. sativa L. infected using Agrobacterium tumefaciens A281 with plasmid pBF649 containing a gene encoding protein of high sulfur-amino acid content (HNP) were obtained successfully. The plants grew and fertiled well in field. Cotyledon explants were better recipient for transformation of M. sativa L. Environment of suitable temperature (15℃) and high humidity on high viability of the plants transplanted into soil were essential conditions.
Key words: Medicago sativa L; HNP gene; transgenic plant
苜蓿（Medicago sativa L.）是世界上最重要的豆科牧草，种植面积约3 500万公顷。苜蓿在我国已有2 000年以上的栽培历史，现种植面积133万公顷［1］。苜蓿既是重要饲料农作物，同时又是改良土壤、保持水土和保护环境的重要作物。苜蓿的营养丰富，蛋白质含量占其干物质重量的17%～20%。然而，苜蓿蛋白质的含硫氨基酸的含量较低。实验证明含硫氨基酸含量的增加可提高羊毛产量22%以上，增产的幅度在22%～104%［2，3］，同时还可增加牲畜的重量。含硫氨基酸的这种独特作用是别的氨基酸不具有的［3］。通过遗传转化方法，将外源高含硫氨基酸蛋白基因转入苜蓿，增加苜蓿植株含硫氨基酸的含量可能是苜蓿改良的有效途径。
外源抗性目的基因转入苜蓿的研究已有成功的报道，如抗除草剂基因［4］，抗病毒基因［5］，和抗虫基因［6］等。外源品质改良基因转化苜蓿的报道很少。本文叙述苜蓿高含硫氨基酸蛋白（HNP）基因转化植株再生的方法、程序和一些影响因素。
1 材料和方法
1.1 无菌实生苗的产生
所试品种为生产用的保定苜蓿。种子先用75%酒精浸泡10min，再用0.1% HgCl2消毒10～20min，无菌水冲洗3～4次，最后接种到MSO［7］上，25℃光照培养，5～7d苗龄的实生苗子叶用于转化实验。
1.2 质粒、菌株和菌液制备
pBF649质粒含有高含硫氨基酸蛋白（HNP）基因，由启动子35S调控，HNP基因长度1.1kb，其中编码区0.8kb，基因两端有Hind和Kpn双酶切位点，另外还含有NPT基因（Pnos）。质粒在大肠杆菌中保存。所用农杆菌菌株为含有双元载体pBF649质粒的A281［8］。基因构建由杜杰完成［9］。将根癌农杆菌A281划线培养在含100mg／L卡那霉素（Kan）的LB或YEB培养基上，挑取单菌落接种到LB或YEB液体培养基中，25℃黑暗振荡培养，对数生长期的菌液用于感染外植体。
1.3 苜蓿外植体的转化、培养和植株再生
取5～7d苗龄的实生苗子叶，切去1／3，将2／3片子叶浸入用MSO稀释3～5倍的菌液中，0.5h后取出，置于无菌滤纸上，吸去表面菌液，接种到UM［10，11］上，子叶和菌共培养4d后转到筛选培养基（UM＋50mg／L Kan＋300mg／L头孢霉素）上，约4周后，把子叶愈伤组织转至MSD4＋100mg／L头孢霉素（Cef）上，再过4周后将体细胞胚（体胚）转到MSO上，诱导完整植株再生［10，12］。
1.4 转化植株的筛选和移栽
切取再生植株的叶片，分成两半，接种到UM＋100mg／L Kan上，Kan抗性植株在室温下放置数天，先移至装有营养土的花盆，成活后再移到大田。
1.5 NPT酶活性检测
按Roy等［13］报道的纸层析法测定。植物材料液氮研磨，用缓冲液抽提，离心，同位素标记，纸层析和X光片压片曝光。
1.6植物DNA的提取
取大田生长植株叶片，液氮研磨，缓冲液提取，酚-氯仿抽担去蛋白，酒精沉淀DNA等步骤按Mettler等报道［14］方法进行。
1.7 Southern blot分析
探针用低融点琼脂糖回收Hind和Kpn双酶切pBF649的基因片段。DNA转移，预杂交，杂交，X光片压片，洗片按分子克隆实验指南［15］的方法。
1.8转化植株含硫氨基酸含量的测定和育性分析
在苜蓿植株开花前，取茎上部的茎叶，烘干，粉碎，盐酸水解，上机测定，氨基酸分析（仪器为日立835-10A型），由中国农科院畜牧所分析室进行。植株育性的检测则是从大田生长植株上采下快开花的花蕾，用解剖刀切开取出花药，在载玻片上用醋酸洋红压片，显微镜下观察。
1.9 转化植株T1代性状分析
1.9.1 Kan抗性测定 从T0植株种子生长的植株，采下上部浅黄色的叶片，经酒精、升汞消毒后接种到UM＋100mg／L Kan上，诱导叶片愈伤组织产生［1０］。
1.9.2 PCR扩增朣outhem blot鉴定 从T1代植株顶部摘取幼嫩茎叶，按上述“1.6”的介绍提取DNA，按HNP基因编码序列0.8kb设计引物进行DNA PCR扩增。
引物序列：5′ ATGTCCAAACCTTTTCTATCTTTGC3′；
引物序列：5′TCACATCAGGCACAGCACGTG3′。
其扩增方法按McGarvey等［16］介绍的进行，探针用低融点琼脂糖回收Hind和Kpn双酶切pBF649的基因片段（1.1kb）、DNA转移、预杂交、杂交等与上述“1.7”介绍的相同。
2 结果与讨论
2.1子叶外植体转化植株再生
子叶外植体经转化处理后，在筛选培养基上诱导愈伤组织，子叶愈伤组织的诱导频率为21%～28%。对照未产生愈伤组织。愈伤组织在MSD4上分化体胚，分化率在70%左右。愈伤组织分化体胚数多的可达数十个（图版I-1），体胚发育成完整植株（图版I-1）。苜蓿实生苗子叶不仅取材容易， 而且转化率高。苜蓿子叶受体比茎段［4，6，17］、 叶柄［4］和叶片［5］更为理想。这与子叶组织的松软而厚、细胞生长快、体胚分化力强［18］的特点有关。A281菌株致病力强，与Chabaud等［19］和Du等［20］的结果一致。苜蓿子叶外植体农杆菌介导转化比实生苗根原生质体电激转化［7］程序简单， 操作方便， 重复性好；比苜蓿基因枪轰击［21］转化效率高得多。再生植株盆栽成活率低，死亡率高，低温（15℃）和湿润环境是苜蓿植株移栽成活率高所必需的［12］。
1. 苜蓿子叶外植体经农杆菌感染的体细胞胚的再生；
1. Somatic embryogenesis from cotyledon of M. sativa L. infected by A. tumefaciens A281 with pBF649
containing a gene encoding protein of rich sulfur-mino acids;
2. 苜蓿子叶外植体HNP转基因植株
2. HNP transgenic plants developed
from somatic embryos of seedling cotyledons of M. sativa L.
2.2 NPT酶显示活性
苜蓿Kan抗性植株的NPT酶显示活性（图1），这说明NPT酶基因已整合到转化植株染色体DNA上。
图1苜蓿HNP转基因植株NPTⅡ酶活性检测
1.正对照;2～4.转基因植株;5.负对照
Fig.1 NPT-Ⅱenzyme activity assay of HNP transgenic alfalfa plants
1.+CK;2 ～4.Transgenic plants;5.-CK
