摘要：以256个随机引物对含小麦抗白粉病基因Pm2近等基因系进行RAPD分析，发现17个随机引物的扩增产物在抗、感NILs材料间表现多态性，且其中5个引物经4次以上重复，均获相同结果，其多态性标记分别为OPM08₁₆₀₀、OPI04₁₇₀₀、OPH19₁₁₀₀、OPE09₉₀₀及OPM16₈₅₀。当以这5个随机引物对14个已知含Pm2基因的抗病材料及9个不含Pm2基因的感病材料进行检测时，只有标记OPI041700在12个抗病材料中出现（另两个抗病材料中未检测到），而在9个感病材料中均未出现。进一步用OPI04对102株（Chancellor×Ulka/8*Cc）F₂分离群体进行分析，估算出标记OPI04₁₇₀₀与Pm2基因间的遗传距离为12.2±3.3cM。

中图分类号：S512.103.4文献标识码：A

文章编号：0379-172（2000）02-139-145

Screening and Study of RAPD Markers Tightly Linked to Wheat

Powdery Mildew Resistance Gene Pm2

LIU Jin-Yuan, TAO Wen-Jing, LIU Da-Jun, CHEN Pei-Du

(Key Open Lab of Agri, Ministry for Crop Cytogenetics, Nanjing Agri. Univ., Nanjing 210095, China)

Abstract: The random amplified polymorphic DNA (RAPD) analysis was made in Pm2 near杋sogenic lines (NILs) with 265 random primers.Seventeen out of the 256 tested primers amplified the polymorphic DNA in the NILs. Five of them showed the same discriminating results in more than four replications. The polymorphic bands were assigned to be OPM08₁₆₀₀, OPI04₁₇₀₀, OPH19₁₁₀₀ and OPE09₉₀₀, respectively. Using these five polymorphic primers to detect 14 resistant materials with Pm2 and 9 susceptible materials without Pm2, only OPI04₁₇₀₀ was amplified in 12 of the 14 resistant materials and absent in all of the 9 susceptible materials. Further RAPD analysis of (Chancellor×Ulka/8*Cc)F₂ plants by primer OPI04 indicated that the genetic distance of OPI04₁₇₀₀ to Pm2 was 12.2±3.3cM.

Key words: wheat; near isogenic line; powdery mildew resistance gene (Pm); RAPD marker

以DNA杂交为基础的RFLP标记是在遗传研究中应用最为广泛的分子标记之一，但由于其在小麦中的多态性水平较低，加之操作过程复杂、成本较高，并需使用放射性同位素，因而限制了它在育种实践中的广泛应用。90年代初由Welsh和Williams^［1,2］两个小组同时提出的RAPD（Random Amplified Polymorphic DNA）技术是近年来发展起来的一种以PCR扩增为基础的新的标记技术。它是用一系列人工合成的寡聚核苷酸单链（通常为9～10bp）为引物，对所研究基因组DNA进行PCR扩增，以揭示相应区域DNA多态性。由于可供选择的引物很多，检测区域几乎覆盖整个基因组，因而多态性水平相对较高。而且RAPD分析程序简单、周期短、所需DNA量较少、自动化程度又高，因而此技术诞生不久，就被广泛应用于遗传作图、基因定位、分子标记筛选、外源染色质检测及物种起源与进化等遗传研究^［3］。在小麦中，借助NILs为材料或集群分离分析（Bulked segregate analysis）方法已分别筛选到与小麦抗黑穗病基因^［4］、抗白粉病基因^［5，6］等紧密连锁的RAPD标记，有的并已成功应用于辅助选择。本文报道的是我们用Briggle^［7］的含Pm2基因NILs进行的RAPD分析，以及所筛选到的与Pm2基因紧密连锁的RAPD标记。

1 材料和方法

1.1 供试植物材料

实验所用小麦近等基因系分别为Ulka／8^*Cc、Idaed59／8^*Cc（简称ID59／8^*Cc）（Pm2）及CI12632／8^*Cc（Pm2＋6）。含已知Pm基因的材料有：Ulka（Pm2）； CI12632、 CI12633、TP114、 Maris Huntsman、 Maris Dove、 PI405718(Pm2＋6)。以上这些材料分别来自南京农业大学细胞遗传所、江苏省农科院粮作所及中国农科院植保所。扬麦5号、扬85?5和扬158是江苏省里下河地区农科所育成并在淮南冬麦区大面积推广的高产品种（系）。扬麦5号和扬158对白粉病中感，扬85?8对白粉病高感。为提高这些品种（系）的白粉病抗性，选用携有Pm2＋6抗病基因的亲本TP114与它们杂交并连续多代回交，从中选出抗病新品系扬94-43、扬95-5和扬95-76，经与Pm2基因紧密连锁分子标记检测，皆含Pm2基因，而且它们的农艺性状已接近或超过扬85-5或扬158。（Chancellor×Ulka／8^*Cc）F₂分离群体用于检测RAPD标记与Pm2基因间的连锁程度。

1.2 基因组DNA提取

DNA大量提取法（CTAB法）参照Gill等^［8］提供的方法，细节上略有修改。DNA微量提取法参照Guidet等^［9］的方法并略加改进。

1.3 PCR反应

随机引物为美国Operon公司产品，长度皆为10bp，随机选用其中265个引物进行扩增筛选。PCR反应体积为25μl，其中含有15～20ng模板DNA，0.2μmol／L随机引物，200μmol／L每种dNTPs，1×缓冲液［10mmol／L Tris-HCl (pH8.5～9.0), 50mmol／L KCl, 2.0mmol／L MgCl₂0.1% Triton-100或0.01% Gelatin］， 1U Taq酶。反应于Perkin-ElmerCetus DNA Thermal Cycler仪上进行。用于引物筛选的扩增条件如下：前4个循环为96℃变性1min， 35℃复性1min， 72℃延伸2min。后45个循环为94℃变性45s， 36℃复性1min， 72℃延伸90s，最后72℃延伸10min。以引物OPI04对不同含Pm2基因材料及F₂分离群体分析时所用扩增条件同上，只是复性温度提高至38℃。

1.4 白粉病抗性接种及鉴定

采用南京和江苏扬州地区田间及温室采集到的白粉病菌混合菌种进行人工接种，在感病对照充分发病的情况下（20℃左右，7～10d），调查记录抗、感分离情况，2～3d后重复调查1次，至抽穗期再调查1次。病级鉴定按盛宝钦^{［10，11］}提出的反应型分级标准进行。

1.5 数据分析

根据Allard （1956）最大似然法计算重组率，并按Kosambi （1944）系数将重组率转化为CentiMorgan (cM)。

2 结果与分析

2.1 白粉病抗性基因Pm2近等基因系的RAPD分析

本研究采用265个随机引物对Chancellor及其含Pm2基因的近等基因系Ulka／8^*Cc及CI12632／8^*Cc进行了分析，其中绝大多数引物均能扩增出1～7条明显可辨的条带。在以265个引物进行第一次初选时，有17个引物的扩增产物在抗、感NILs材料间揭示出多态性，但在随后对此17个引物的重复实验中，只有5个引物经4次以上重复，均获相同的结果。这5个引物扩增产物的多态性可分3种类型：（1）抗病NILs中的扩增带较感病亲本多1条（图1），如引物OPM08（5′ TCTGTTCCCC 3′）、OPI04 （CCGCCTAGTC）和OPH19（CTGACCAGCC）。它们分别在1.6kb、1.7kb、 1.1kb处多出1条特异带， 分别被标记为 OPM08₁₆₀₀、OPI04₁₇₀₀、OPH19₁₁₀₀。由此推测，由于抗病基因的引入而增加了适于这类引物之结合位点，因而特异带得以出现。（2）抗病NILs中的扩增带较感病亲本少1条（图2，a）。引物OPE09（CTTCACCCGA）在感病亲本中扩增出大小约为0.9kb的特异带，标记为OPE09₉₀₀，而NILs中缺少此特异扩增带。推测由于抗病基因的引入，破坏了引物在此处的结合位点，致使这一片段得不到扩增。（3）抗、感材料间扩增出的特异带位置相同，但带的强弱差异显著（图2，b）。引物OPM16（GTAACCAGCC）在抗、感材料中皆扩增出一大小约为0.85kb的扩增带，标记为OPM16₈₅₀，其在感病亲本中的强度明显高于抗病NILs中的，原因可能是感病材料中，此处引物结合位点较抗病NILs中的更适于其扩增，如果提高复性温度，NILs中的这条弱带也许会消失。

图1引物OPM08(a)、OPI04（b）及OPH19（C）的PCR 扩增结果箭头示多态性PCR扩增片段

Fig.1 The PCR ammlification results with primer of opm08(a),OPI04(b)and OPH19(c)M₁.50～2000bp ladder (BIO-RAD ),M₂,λ DNA HindⅢ/EcoRI,C.Chancellor ,U Ulda/8*Cc.D,ID59/8*Cc,I CI126328/8*Cc.Arrows show the polymorphic amplification bands

图2引物OPE09（a）、OPM16（b）的PCR扩增结果CS。中国春；C、U、I的解释见图1箭头示多态性PCR 护增片段

Fig.2 The PCR amplification results with primer of OPE09(a)and OPM16(b)CS.Chinese Spring,C,uIsee Fig.1 Arrows show the polymorphic bands

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