摘要： 将西瓜野生种质PI296341抗枯萎病生理小种1的抗性基因连锁的RAPD标记OPP01/700进行克隆、测序，Southern杂交证明此标记为1个单拷贝，并转化为SCAR标记，简化了SCAR扩增产物的检测技术。上述技术在抗病转育后代选择中得到了很好的应用，初步建立了西瓜抗枯萎病育种分子标记辅助选择技术系统。

中图分类号： Q789 文献标识码： A

文章编号：0379-172(2000)02-151-157

Studies of Molecular Marker-assisted-selection for Resistance to Fusarium Wilt in Watermelon (Citrullus lanatus) Breeding

XU Yong, ZHANG Hai-Ying, KANG Guo-Bin, WANG Yong-Jian, CHEN Hang

(National Engineering Research Center for Vegetable, Beijing 100089, China)

Abstract: The RAPD marker OPP01／700 proved to be linked to the Fusarium wilt resistant gene in watermelon wild germplasm PI296341 was cloned and sequenced, and transferred into a SCAR marker. The linked marker was tested to be one copy by Southern blotting. The technique of detection of the SCAR-amplified products was simplified. These techniques were applied in selecting resistant plants in F3 of the introgression of the disease resistant gene. It is the first report in this field of transfer ring a RAPD marker linked to disease resistance gene into SCAR marker, and establishing the technique of molecular marker-assisted-selection for breeding Fusarium wilt resistance cultivars.

Key words: watermelon (Citrullus lanatus); Fusarium wilt resistance; SCAR; RAPD;molecular marker-assisted-selection

西瓜枯萎病是世界范围内西瓜生产最严重的障碍，培育抗枯萎病品种是解决这一问题的有效途径^［1］。西瓜枯萎病菌［Fusarium oxysporum f. sp. niveurn (E. F. Smith） Synder & Hensen］存在3个生理小种0，1，2^［2］。我国大多数学者认为中国以生理小种1占主导^［3～5］。野生西瓜材料PI296341是国际上目前公认的唯一1份抗枯萎病3个生理小种的抗源^［6］，由于其农艺与品质性状极差，不能直接作为育种材料来使用，需要将其优良抗性转育到商业品种上，但由于传统育种的转育方法的效率较低，需要建立一种全新的更为有效的育种选择方法，分子标记技术的建立与发展为解决这一问题提供了有效途径^［7］。

本实验室已报道了与枯萎病生理小种1抗性基因连锁的RAPD（random amplified polymorphic DNA)标记OPP01/700^［8］。本文采用SCAR（sequence characteristic amplified region）技术，将连锁的RAPD标记转化为以PCR为基础的检测标记，通过简化SCAR扩增产物的检测技术以及在抗病转育后代选择中进行验证，初步建立了西瓜抗枯萎病育种分子标记辅助选择技术系统。这为高效利用西瓜野生种质的优良抗病性状提供了可能，也为最终定位与克隆西瓜野生种质的抗病基因打下了良好基础。

1 材料和方法

1.1 试材

实验所用的西瓜野生材料（Citrulls lanatus var. citroides）由美国Clemson大学Rhodes教授赠送，代号为PI296341，该材料来源于非洲，在当地称为Tsamma西瓜，其农艺性状较差，生长势旺，甜度低，皮厚，耐贮运。普通西瓜（Citrullus lanatus var lanatus）材料

为“京欣一号”父本自交系，代号为97103，及97103×PI296341杂交获得的F₂代105个单株与F₃代88个单株。

1.2 方法

1.2.1 西瓜苗期抗枯萎病鉴定方法接种方法为国际通用的浸根法^［9］。西瓜枯萎病菌为尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）西瓜专化型生理小种1，采自北京通县。病情分级标准按Martyn等^［9］的标准进行分级，2级以下为抗病植株，3级以上为感病植株，具有典型病害症状的植株确定为感病植株。接种存活的单株，再进行切根灌菌液处理，以进一步鉴定其抗病性，灌根处理10～15d调查其死苗情况，最终存活的植株定为抗病植株。

1.2.2 DNA提取方法采用本实验室已报道的西瓜DNA快速简单提取方法^［10］。

1.2.3 RAPD朠CR扩增反应体系与程序25μl的反应体系中含有10×buffer(Tris-HCl10mmol／L pH8.0, KCl 50mmol／L, MgCl₂ 2.0mmol／L)2.5μl, 2.5mmol／L dNTP 2.0μl,引物30ng，TaqE 1U，模板DNA 10ng。引物与dNTP购自上海生工公司（为与国际交流，将上海生工公司引物S编号转成OPERON公司的引物编号），TaqE购自北京泰克金公司。扩增程序为94℃变性30s，37℃复性30s，72℃延伸1min，35个循环。PCR仪为美国PE公司生产的PE-480扩增仪。

1.2.4 电泳检测扩增产物取10μl反应产物，与2μl溴酚蓝（0.25%溴酚蓝，40%蔗糖水溶液）混匀，点入含0.5μg／ml EB的1.5%琼脂糖凝胶中，在5V／cm电场强度下电泳1～2h，以λDNA／EcoRⅠ＋HindⅢ做标准分子量标记，确定DNA片段在胶上的相对位置，利用Kodak EDAS-120凝胶分析仪进行凝胶分析。

1.2.5 与抗枯萎病基因连锁的RAPD标记OPP01/700的回收、纯化与克隆将所需条带在紫外灯下挖出，放入Eppendorf管中，如果条带所含的DNA量较少，则加入200μlddH₂O，在94℃溶解5min，取2μl DNA溶液进行重扩增，电泳检测，剩下的重扩增溶液进行纯化。采用Wizard PCR DNA纯化系统纯化。RAPD产物与载体的连接采用Promega公司的PGEM-easy vector系统。参照《分子克隆实验指南》进行重组质粒的转化与筛选。利用碱法提取重组质粒，采用酶切与PCR进行检测。

1.2.6 利用地高辛标记进行Southern杂交分析CTAB法［11］提取抗病亲本和感病亲本的DNA各2份。以EcoRⅠ单酶切、与BamHⅠ单酶切50g DNA。在0.7%琼脂糖凝胶电泳，溴酚蓝至全长3／4时停止电泳，拍摄凝胶后开始转膜。参照《分子克隆实验指南》中的方法进行转膜。采用美国Boehringer Mannheim公司的DIG High Prime Labelling and Detection Starter Kit I进行探针标记。探针标记与膜杂交及显色方法参照试剂盒说明书进行。

1.2.7 OPP01／700片段的测序委托中科院微生物所测序并提供结果。

1.2.8 SCAR标记引物的设计与扩增在OPP01／700片段2端包括RAPD引物的10个碱基再延长12～17bp，并检查所设计的引物是否形成发卡结构、退火温度是否大于50℃等引物设计的一般条件。利用已设计的引物对，进行SCAR扩增，扩增条件为94℃预变性5min，94℃变性1min，不同退火温度（45℃、50℃、55℃、60℃）退火1min，72℃延长2min，35个循环。

1.2.9 SCAR扩增产物的快速检测扩增管中加入50ng／ml EB，点到Parafilm膜上和

酶联板孔中，或点到含有EB的1% Agarose胶的点样孔中，在紫外灯下观察照相，或在高压200V电泳10min。比较几种方法的检测效果。

1.2.10 SCAR标记在抗性转育后代中的验证对F₃代随机抽取88个单株进行苗期抗病性鉴定，并同时进行SCAR分析，比较上述2个结果，计算SCAR标记鉴定的准确率。

2 结果与分析

2.1 与西瓜抗枯萎病基因连锁的RAPD标记OPP01/700的克隆与测序

我们已报道与西瓜野生材料PI296341抗枯萎病基因连锁的RAPD标记OPP01/700，它与抗枯萎病基因之间的连锁距离为3.0cM^［8］。

OPP01/700片段经回收纯化得到高质量的DNA，然后与PGEM- easy Vector连接，并转化到E. coli中。检测6个白斑克隆，经酶切与PCR扩增检测，其中4个克隆均有插入的目的片段，表现为阳性。将其阳性克隆进行测序，结果表明：在序列的两端均有RAPD的OPP01引物的结合位点，这进一步证实了克隆片段的正确性。同时，在2条所测的序列上存在互补碱基区。通过计算，OPP01／700片段的碱基数目为697个。

2.2 OPP01／700片段的Southern杂交检测

Southern杂交检测表明：经EcoRⅠ单酶切，在抗病亲本的DNA上能杂交到1条带而感病亲本上无带（图1）。上述结果初步证明：本实验所获得的抗病连锁标记为单拷贝标记，这将十分有利于将抗病基因定位在遗传图谱上。

图1Southern杂交检测结果1～4。ExoRI酶切的抗、感亲本DNA；CK。回收的OPP01/700

Fig.1 Results of Southern gybrization detection 1~4.Disease resistant adn susceptible parents DNA digested with Eco RI respectively;CK Re-amplified fragment of OPP01/700

2.3 将与西瓜抗枯萎病基因连锁的RAPD标记OPP01／700转化为SCAR标记依据OPP01/700片段测序的结果，在原有OPP01引物10个碱<