摘要：以霍乱毒素B亚基（CTB）为载体，由其基因构建了含有不同时期不同抗原表位的恶性疟原虫的融合基因CTB～AWTE、CTB～NANP，前者除含有恶性疟原虫裂殖子表面主要抗原表位杂合多肽基因SPf66外，还含有很强的T辅助细胞表位CST3和Tc细胞表位，后者含有子孢子期的B、Th细胞表位。将纯化的质粒免疫Balb／c纯系小鼠，3次免疫后诱导机体产生了体液免疫和细胞免疫，免疫的小鼠进行疟原虫子孢子攻击实验，保护率为60%～80%。将纯化的质粒混合后免疫恒河猴，3次免疫后诱导机体产生了体液免疫和细胞免疫，免疫的恒河猴进行食蟹疟原虫攻击实验，显示了一定的保护作用。

中图分类号：Q342.4文献标识码：A

文章编号：0379-172（2000）02-095-100

Assessment of Malaria DNA Vaccines in Mice and Monkeys

ZHONG Hui, CAO Cheng, LI Ping, LI Jie-Zhi, MA Qing-Jun

(Institute of Biotechnology, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100850, China)

Abstract: Cholera toxin B subunit is a good carrier protein and an effective adjuvant which can boost both cellular and humoral immunity. DNA fragments encoding B cell,Th cell and CTL epitopes of P. falciparum CS, MSA-1, MSA-2 and RESA antigens were cloned down-₂ stream of cholera toxin B subunit gene in the same reading frame.High titer of anti-alaria epitopes antibodies and strong cellular immunogenicity were elicited afterBalb／c micewere immunized three times with 100g recombinant plasmid DNA dissolved in 100μl PBS. A total of 120 vaccinees were challenged with mouse Plasmodium yoelli to investigate if cross protection existed. The protective efficacy was about 60%～80%. Four rhesus monkeys were challanged with 10⁸ of P. cynomalgi, better results were obtained in the groups immunized with mixed plasmids including NANP, AWTE.

Key words: cholera toxin subunit B; DNA vaccine; P. falciparum

疟疾是严重的寄生虫病，每年大约有300万人死于疟疾［1］，在我国的海南、云南地区，疟疾流行仍较严重。由于抗药性的产生，给药物治疗带来困难，因此，研制有效的疟疾疫苗一直受到极大的重视。由于疟原虫的生活史极为复杂，疟原虫感染人体恢复后未见有明显的免疫保护作用，因此疟疾疫苗研究遇到了极大的困难。近年来，随着分子生物学等现代技术的发展，对疟原虫抗原及免疫保护作用的研究日益深入，出现了以杂合多肽Spf66为代表的疫苗应用于临床实验，但其免疫效果不肯定。基于过去疫苗研究的进展，我们认为要研制有效的疟疾疫苗必须（1）尽可能包含疟原虫各生活期的保护性抗原表位，（2）必须通过有效的免疫增强途径，提高机体对抗原的免疫应答水平，（3）必须优先考虑CTL效应。 按上述设想，（1）由于DNA疫苗的一个独特之处是能够诱导机体产生CTL反应，所以我们利用DNA疫苗来研究疟疾疫苗；（2）由于CT是有效的疫苗佐剂，我们选用CTB作载体，让疟原虫抗原表位与CTB在基因水平融合；（3）获得了编码含有疟原虫子孢子CS抗原B表位、CTL表位、裂殖子抗原B表位及广谱的NKNDD表位在内的多抗原表位融合基因CTB朜ANP朇ST3及CTB朅WTE。本研究以小鼠和恒河猴为模型，进一步研究了恶性疟原虫DNA疫苗诱导产生的免疫反应以及对应疟原虫攻击的保护作用。

1材料和方法

1.1质粒及菌株

重组质粒pCMV朅WTE与pCMV朜ANP、pCMV朓L2的构建请见文献［2］。AWTE与 NANP为人工合成的恶性疟原虫抗原基因T、B细胞表位的串联基因。pCMV空质粒含有CMV极早期启动子，由宾洲大学王宾教授惠赠。

1.2实验动物及攻击用虫株

Balb／c（16～20g）小鼠及恒河猴均购自军事医学科学院实验动物中心，小鼠约氏疟原虫由首都医科大学保存。食蟹猴疟原虫由军科院5所时运林教授提供。

1.3试剂

羊抗鼠IgG朒RP、金葡菌A蛋白（SPA）朒RP购自华美生物工程公司，其他试剂为国产分析纯。

1.4子孢子的制备

感染约氏疟的桉蚊（雌蚊）剪去腹部后，加入生理盐水研磨匀浆，显微计数，用无菌生理盐水将子孢子浓度调整为1.25×10⁵／ml，备用。

1.5疟原虫特异性CTL细胞测定

1.5.1刺激细胞的制备取与免疫组同源的小鼠脾脏，制成脾细胞悬液，调整细胞浓度至2.5×10⁶／ml，加入1～10g／L（5～50g）的相关肽（溶在含2g／ml ConA的R1640中），于37℃ 5% CO₂孵箱中保温4h。阴性对照采用不相关抗原刺激。离心细胞后，悬于含丝裂霉素50g／ml的PBS中，于孵箱中37℃ 1h，用PBS洗涤细胞4次，以除掉丝裂霉素。

1.5.2效应细胞的制备最后一次免疫2周后，活杀小鼠取脾制备脾细胞悬液，调整细胞浓度至30×10⁶／ml，于37℃ 5% CO₂孵箱中与2.5×10⁶／ml的刺激细胞作用4～6天。 靶细胞的制备：实验前24h将靶细胞P815进行传代培养，使用前用含15%小牛血清的1640全培养液调整细胞浓度至3×10⁶／ml，加入10g／L相关肽于37℃ 5% CO₂孵箱中作用90min。用培养基洗3次。

1.5.3CTL细胞活性的检测96微孔板上划分好样品（S）、自然释放（N）及最大释放（M）孔，根据不同的效靶比（E／T）将所有不足体积的孔补充至200l，每孔至少做3个平行。37℃ 5% CO₂孵箱中培养20～24h后，取100l上清到另一微孔板中，立即用酶联仪在波长490nm下进行测量，每隔1min记录一次OD值。计算每一孔的平均每分钟OD变化值，按如下公式计算CTL活性（S为样品释放，M为最大释放，N为自然释放）：CTL（%）＝S－N／M－N，详见参考文献［3］。

1.6CTB抗体的测定

用ELISA检测，以CTB抗原包被，每孔500ng，20%小牛血清封闭12h，免疫后血清按1100、1200、1400、1800、11600、13200系列稀释，37℃温育后加入酶标抗CTB抗体（13000），OPD显色，测OD₄₉₂值^［4］。

1.7抗疟原虫抗原表位抗体的测定 通过化学合成，分别获得了NANP（串联3次），Pf83.1及Pf153.1抗原多肽，合成肽用2mol／L醋酸溶解后包被酶联板（500ng／孔），封闭后加入待检血清，酶标SPA，OPD显色。

1.8免疫荧光 恶性疟原虫子孢子或裂殖子涂片，固定，加入适当稀释的血清，洗涤后加入FITC标记的二抗，在荧光显微镜下观察结果^［5］。

1.9裂殖子的制备 感染食蟹疟的恒河猴静脉取血，加入肝素和生理盐水，显微计数，用无菌生理盐水将子孢子浓度调整1×108／ml，备用。

2结果与讨论

2.1以小鼠为模型的恶性疟原虫DNA疫苗的免疫效应

80只Balb／c 4～6周小鼠，雌雄各半，随机分为以下2组，每组40只，以构建的pCMV-WTE、pCMV-ANP、pCMV-L2 3种质粒等量混合，免疫接种。对照免疫接种生理盐水，免疫组300μg／只。肌肉免疫3次，每次间隔15d，末次免疫后30d进行小鼠抗CTB抗体和CTL活性的测定。

2.1.1抗CTB抗体混合质粒免疫小鼠后抗体的消长情况如图1，在第3次免疫后10dCTB抗体的滴度达13200。

图1恶性疟原虫DNA疫苗免疫小鼠后CTB抗体产生曲线

Fig.1CTB antibody titers after immunized Balb/c mice with malaria DNA vaccine

2.1.2抗疟原虫抗体在第3次免疫后10d的血清稀释后进行免疫荧光检测，在11000时仍有强的荧光，表明恶性疟原虫DNA疫苗免疫小鼠后能产生高滴度的抗疟原虫表位抗体（11000）。 从以上结果我们可以看出混合注射恶性疟原虫DNA疫苗不但产生了针对CTB的抗体，也产生了针对AWTE与NANP的抗体，说明这种融合基因注射肌肉后在体内表达的融合抗原形式并没有改变抗原的免疫原性。

2.1.3CTL效应抗原免疫小鼠3次后用LDH法测定疟原虫特异的CTL细胞活性，免疫组CTL活性为37%，对照组几乎不能特异性地裂解靶细胞，说明恶性疟原虫DNA疫苗免疫后诱导机体产生了特异性的细胞毒淋巴细胞毒性。

2.1.4对约氏疟子孢子攻击的保护作用小鼠末次免疫后30d进行约氏疟原虫子孢子攻击，低剂量攻击剂量为12500个／只，高剂量攻击剂量为25000个／只。攻击结果见图2，经t方差分析，t＞P_0.01，免疫组与对照组攻击后的未感染率差异极显著，表明由pCMV-WTE、pCMV-ANP及pCMV-L2 3种质粒混合构建的恶性疟原虫的DNA疫苗，取得了很好的效果，3次免疫后能耐受12500～25000个子孢子的攻击，未感染率达60%～80%。免疫组即使感染的小鼠，其感染时间要比未免疫接种的对照组要推迟2d以上<