摘要：以大造、C108及其F2群体构建了1个家蚕的RAPD连锁框架图，该图含RAPD标记位点182个，来自大造的103个标记分属前23个连锁群，来自C108的79个标记分属后16个连锁群，覆盖基因组的总长度为1148.3cM（centimorgan），它能与本室用同一群体构建的SADF图谱相整合，亦可与相应的RFLP图谱相互补充。

中图分类号：S881.24文献标识码：A

文章编号：0379-172（2000）02-127-132

Construction of Silkworm RAPD Molecular Linkage Map

LI Bin, LU Cheng, ZHOU Ze-Yang, XIANG Zhong-Huai

(The Key Sericultural Laboratory of Agricultural Ministry，Southwest Agricultural University, Chongqing 400716, China)

Abstract:In this research, a RAPD linkage map of Bombyx mori was constructed with Dazao／C108 and their F2 generation. The map consists of 182 RAPD loci, of which 103 loci come from Dazao and form the first 23 linkage groups and the other 79 loci come from C108 and form the second 16 linkage groups. This map covered a total genetic distance of over 1148.3 cM (centimorgan). It could be integrated with the SADF map of the same materials constructed in our laboratory and the corresponding RFLP linkage map.

Key words:random amplified polymorphic DNA; molecular linkage map; silkworm (Bombyx mori)

自Goldsmith等于1991年提出国际蚕分子育种计划以来^［1］，家蚕分子连锁图的构建相继在各国展开。Goldsmith等率先建成了以P50和C108为亲本的家蚕RFLPs图谱^［2，3］。因家蚕可用探针数少，此项工作受到了限制。于是随机引物扩增多态性DNA（RAPD）技术进入了家蚕作图工作。如Promboon等以P50和C108为亲本构建了159个标记的家蚕RAPD图谱（其中含1个形态标记）^［4］，而家蚕自田中义磨（1913）发现了蚕的连锁遗传以来，历经80余年研究，现已发现和研究了440多个基因，确定了27个连锁群，定位了220多个位点和300多个基因^［5］。为进一步完善与丰富家蚕分子连锁图，建立与常规遗传图谱的对应关系，以推进家蚕种质资源、遗传育种及基因克隆等研究，我们应用RAPD标记，构建了182个标记于连锁图上。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 家蚕材料大造、C108、大造杂交C108的F1代以及104个F2代个体，为西南农业大学家蚕基因库提供。

1.1.2 主要试剂Taq酶和dNTPs来自Promega公司，Primers 购自Operon公司。

1.2 方法

1.2.1 家蚕基因组DNA的制备参照稍做改进的Maniatis的方法进行^［6］。

1.2.2 RAPD扩增RAPD扩增反应参照Williams^［7］和夏庆友^［8］的方法并略加调整，RAPD反应体系（25μl）含有100mmol／L Tris-Cl pH 8.3, 500mmol／L KCl, 1% Triton X-100, 2.0mmol／L MgCl₂, dATP、 dTTP、dCTP和dGTP各为0.2mmol／L，随机引物0.2μmol／L，10～20ng模板DNA，1U Taq DNA聚合酶。反应扩增条件为94℃变性30s，40℃退火60s，72℃延伸90s，35个循环之后接着72℃ 7min。扩增产物用1.2%琼脂糖凝胶检测分析。

1.2.3 连锁分析根据RAPD扩增电泳结果，将每个F₂个体的电泳带型按亲本类型归类，与大造带型相同者赋值为1，与C108带型相同者赋值为2，带型不清或数据缺失者赋值为0，然后将数据输入计算机进行分析。计算机连锁分析采用MAPMAKER/Exp （Version3.0b）软件^［9］，具体分析参照Promboon等的方法^［4］。

2 结果分析

2.1 亲本的RAPD多态性分析

用425个GC含量为60%～70%的RAPD引物分别在大造、C108两亲本和大造×C108的F1间进行多态性筛选扩增（图1），其中有137个引物586个位点在两亲本间表现多态性，随后用这137个具有多态性的引物分别对104个F₂个体进行RAPD扩增，其中69个F₂个体获得稳定、较好的扩增结果，以此确定其个体的表型，586个多态性扩增位点的片段大小在0.2kb～2.5kb之间，引物扩增多态性片段数在1～11条，平均为4.3条。

图1在家蚕C108与大造间筛选多态性标记

Fig.1 Selection of polymorphic fragment between c108 and Dazao strains M.size marker ;C,C108;D Dazao;F₁.(D×C)F₂(D×C);M.Size marker

本研究RAPD引物在大造和C108间扩增多态性的比例为32.3%（425个引物中有137个引物可扩增出多态性片段），高于已报道的水稻间的20%^［10］，桃树间的16%^［11］，与Promboon等所作的家蚕间的34.3%^［4］接近。可利用引物率高对家蚕分子图谱的构建显得较为有利，可定位出更多的多态性位点。同时本研究中每个引物平均扩增片段数为11.7条，高于类似的RAPD研究中的平均扩增带数，如陈洪等使用1.6mmol/L的游离Mg^2＋在水稻中平均得到3.6条扩增片段^［10］，在鱼类研究中得到平均扩增片段5.4条^［12］，Majid等使用4.5mmol／L的游离的Mg^2＋在番茄中平均得到6.5条扩增片段^［13］。Mg^2＋浓度较高的反应系可扩增出较多的片段，而我们采用了较为严谨的Mg2＋浓度（2mmol／L），说明本研究中平均扩增片段数较多与家蚕基因组特性有关。

2.2 F₂群体中RAPD标记的分离

我们对RAPD分析数据进行卡平方（x²）测验，在5%水平上发现本研究中470个标记（占总标记数的80.2%）符合31的分离比率，显示孟德尔遗传。发生偏离的标记为19.8%，与类似RAPD研究中的偏离水平基本相当。图2显示了引物OPF02的RAPD扩增片段在F₂代中的分离情况。

图2引物OPF02的RAPD 片段在F₂代中的分离

C.C108;.大造;F₁与F₂(D×C);M Size marker

Fig.2 The segregation of RAPD fragments amplified with primer OPF02 in the F₂ generation C.C108 D.Dazao;F₁(D×C)F₂(D×C);M Size marker

2.3 连锁图构建

构建连锁图时，首先确定RAPD标记所属连锁群及其位点序列，校正类型错误并计算其图距，利用MAPMAKER/Exp（Version3.0b）软件设置最小Lod值为3.0，将470个RAPD标记分成39个连锁群，来自大造的103个标记分属前23个连锁群，来自C108的79个标记分属后16个连锁群，不连锁标记288个，由此构建家蚕RAPD分子连锁图，如图3所示。我们根据RAPD标记来源不同，将其划分为两大类，来自大造的每个连锁群包含2～24个标记，平均每个连锁群4.5个标记，其中第4连锁群位点较多，它可进一步分为4a与4b两个连锁群，连锁群长度在13.8～163.6cM，连锁群总长度1192.5cM，平均每个连锁群长度为49.7cM，两标记间平均图距为11.6cM；来自C108的每个连锁群包含2～12个标记，平均每个连锁群4.9个标记，连锁群长度在6.2～235.2cM，连锁群总长度1104.2cM，平均每个连锁群长度为69.0cM，两标记间平均图距为14.0cM。框架图中各连锁群位点分布较为均匀，基本体现了RAPD标记在基因组中分布的随机性与均匀性。

图3家蚕的RAPD图谱

Fig,3 Silkworm RAPD map

3 讨论

家蚕与其他脊椎动物不同，具有雌完全连锁的特性，因而将导致以下问题出现：即当两标记处于互斥状态时，我们不能确定遗传连锁的序列。如X－y／x－Y即为互斥，此时X与Y彼此连锁，x与y是X与Y各自的隐性等位基因，因为x与y不能同时在F₂个体中出现，于是我们不能计算其重组值，因此在互斥时不能确定RAPD标记的位点序列，利用MAPMAKER不能很好地将来自不同亲本的RAPD标记调整到同一连锁群中。但处于互斥状态的标记，定然会有连锁的情形，而分开计算可能将本应连锁的部分标记处理为不连锁，这也许可能是不连锁位点较多的一个原因。

目前各研究小组用于作图的群体大小因物种及材料配制的不同而有较大差异<