摘要：Nodal基因属于TGF－β超家族。它在小鼠原肠期的原条形成过程中起重要作用。Nodal基因的缺失导致中胚层不能形成。使小鼠死亡。用一系列含有Nodal基因5′侧翼序列其缺失体的荧光素酶报告基因质粒瞬时转化F9细胞。通过分析这些报告基因质粒的荧光素酶活性，在转录起始点上游的1kb处的EcoRⅠ附近找到一个抑制子元件。该抑制子元件的核心部分位于EcoRⅠ位点下游约200bp处，它几乎可以完全抑制Nodal基因启动子的活性。但对于SV40启动子没有影响。在不同的细胞种类中它的作用不同，在CHO细胞中它具有增强活性。

中图分类号：Q789文献标识码：A

文章编号：0379-172（2000）02-101-107

Analysis of a Suppressor Element of Mouse Nodal

Gene in Its 5′ Flanking Sequences

HU Xin-Li, ZHOU Xun-Lei

(College of Life Sciences, Department of Cell Biology and Genetics, Peking University,

Beijing 100871, China)

Abstract: Nodal gene is a member of the TGF-β superfamily. It is required for the formation of the primitive streak during mouse gastrulation. Mice without Nodal gene will die due to the lack of mesoderm formation. F9 cells were transiently transfected with a series of luciferase reporter constructs containing the subcones of Nodal 5′filanking sequences and their deletions. By analyzing the luciferase activity of these constructs, a suppressor element was determined at about 1kb up stream the transcription initiation site, around an EcoRⅠ site. Its centrol part was located at sbout 100bp downstream of that EcoRⅠ site. It could almost totally, suppress the Nodal gene promoter activity, though it had no effect on SV40 promoter. It behaved differently in different cell lines. In CHO cells, it had an activation activity.

Key words: Nodal gene; expression regulation; promoter; suppessor element

Nodal基因^［1］首先在5.5d的小鼠胚中表达^［2］，此时正是胚胎的原条开始形成的时候，随后它的表达集中原条前端的原结附近，这个区域相应鸡胚亨氏结与爪蟾的背唇，这些结构对于中胚层的发生起组织者作用。在第8.5d随着原结的消失，在鼠胚中不能再检测到Nodal基因mRNA的表达。而且Nodal基因编码的蛋白质是一种分泌型的信号分子，属于TGF-β超家族。由此推测，Nodal基因是一个在胚胎早期发育中中胚层发生以及其后的体轴形成过程中起重要作用的基因。

Nodal基因失活的纯合小鼠4.3d在原肠胚发育过程中，胚胎外层和胚外外胚层过度增殖，而没有中胚的形成，导致胚早期死亡^［3，4］。

Nodal基因还可能对小鼠发育早期左右体轴的形成和左右不对称结构的发生起决定作用［5，6］。

已知Nodal基因的表达具有严格的时空限制，研究它的表达调控有助于我们认识和分析胚胎发生过程中中胚层的诱导分化和体轴形成的分子机制。

本文对Nodal基因侧翼序列的各亚克隆及缺体进行了分析。以荧光素酶为报告的基因的质粒瞬时转化F9和其他一些细胞，找到Nodal基因的5′末端的某些顺式调控元件。

1材料和方法

1.1质粒构建Nodal基因的侧翼序列用适当限制性内切酶酶切后克隆入pBluescriptKS（图1）制备克隆。本研究中所用的表达载体为pGL2-B（promega），简称为B。pGL2-B上没有启动子和增强子，只有荧光素酶报告基因（图2）。为了制作系列缺失体的需要，将pGL2-B多克隆位点中XhoⅠ酶切位点消除。用XhoⅠ酶切，再用Klenow处理，填平粘性末端；最后用连接酶连接。经过上述改造得到的载体称为pGL2-Bx，简称为Bx。选择适当的酶切位点将基因组及其侧翼DNA各片段从pBluescript质粒切下，克隆到表达载体pGL2-Bx的荧光素酶报告基因前面。克隆后进行系列缺失体构建，即以绿豆核酸酶取代SI核酸酶，省去SI酶切后的Klenow处理，直接用T4 DNA连接酶将缺失后的DNA连接起来，形成缺失本，转化感受态大肠杆菌DH10。

图1Nodal 基因侧翼序列的各亚克隆的图谱

Fig.1 The subclones of the flanking sequences of Nodal gene

图2PGL2-B质粒图谱

Fig，2 PLASMID OF pGL2-B

1.2细胞培养F9畸胎瘤细胞（由中国科学遗传研究所蒋耀青教授实验室提供）及ES

细胞（本实验室建立的MESPU-13）均使用DMEM（高糖）培养基（GIBCO），补以20%的新生牛血清（天津生化制品厂）培养。CHO、HeLa、STO及小鼠胚胎原代成纤维细胞（均由本实验室提供）以DMEM培养基，补以10%新生牛血清培养。所有细胞均培养在5%CO₂，37℃培养箱中，根据其生化情况，按一定比例隔天传代一次。

1.3DNA转化用脂质体法转化细胞（Lipofectmin^TM，GIBCOBRL），转化前一天接种适量的细胞，用等量的质粒DNA转化细胞。每次转化都共转化含有SV40启动子和半乳糖苷酶的pSV-βgal质粒（Promega）作为检测转化效率的内源对照。转化后48h，用PBS将细胞洗两次，加入100ml细胞裂解液（Promega），于室温下放置15min将细胞裂解。将细胞裂解液移入0.5ml的Eppendorf管，存于液氮中待测活性。

将2μl细胞裂解液及50μl荧光系酶底物在0.5μl的Eppendorf管内混匀，置于液闪计数器测定荧光酶活性，以CPM来表示。用96孔板测β-半乳糖苷活性.在每个孔中加入50μl细胞裂解液和50μl2 ×Assay Buffer（Promega），在37℃下保温30min后，用150lμ1mol／L的Na₂CO₃终止反应置酶标仪上，于420nm处读取光吸收值，以ρ表示。

以共转化的β－半乳糖苷酶的活性（β）作为内源对照，以/β为系数（以每次转化的β-半乳糖苷酶活性的平均值),比较各组在转化效率相同时荧光素酶活性的相互关系,即比较CMP^1／2／β值的平均值。以没有任何插入片段时pGL2-P的荧光素酶活性增加的倍数，即荧光素酶的相对活性RLUC。RLUC反应是荧光素酶基因表达的相对水平。

1.4DNA序列测定T7 DNA聚合酶序列测定试剂盒购自Phamacia公司，实验方法按试剂盒中提供的程序进行反应。

2结果

2.1BNH 0.4和BNR 1.0质粒的构建

用KpnⅠ＋SacⅠ分别从pBSNH 0.4质粒和pBSNR1.0质粒的多克隆位点中分离出含有NH 0.4和NE1.0片段的KS 0.4和KS1.0片段，然后将它们分别克隆到pGLZ-B载体的相应位点中，得到BNH 0.4质粒和BNR1.0质粒。

2.2NR1.0亚克隆片段缺失体的构建（图3）

图3抑制子子元件各缺失体示意图

Nodal 基因；——不含抑制子的缺失体部分；——含抑制子的缺失体部分

Fig,3The indicative figure of various size deletion of suppressor

Nodal gene ;——The part of deltion without the rpressor ;——The part of deletion with the repressor

同样用KpnⅠ＋SacⅠ从pBSNR1.0质粒中分离出NR1.0片段，再次克隆到pGL2-Bx载体的相应位点上。然后，以KpnⅠ酶切该质粒，产生3′凸出末端来保护载体骨架，用XhoⅠ酶切，产生5′凸出末端。 用外切酶Ⅲ在25℃条件下酶切1、2、3、4和5min后，得到插入片段长度分别还是950bp、880bp、800bp、700bp、600bp和520bp的缺失体，分别称为Bx1.0D-1、Bx1.0D-2、Bx1.0D-3、Bx1.0D-4、和Bx1.0D-5（图3）。用SmaⅠ＋SacⅠ双酶切，游离出插入片段，其电泳结果见图4。

图4BXNR1。0及其缺失片段酶切谱

BXNR 1。0经Smal I+SacI双酶切；λDNA/Bst EII ;2.BxNR1.0