摘要：报道了玉米花色素苷合成调节基因C1-R在小麦幼胚、玉米愈伤组织、水稻愈伤组织、烟草叶片中的瞬时表达情况。由于调节基因C1-R激活了植物体细胞内花色素苷的合成，因此不需任何生色底物，即可活体观察到花色素苷的表达。结果表明，对于目前仍主要通过基因枪法转化的几类主要粮食作物——小麦、玉米、水稻、枪击48h后，放大2倍便清晰可见红色斑点，且其表达强度远高于GUS的表达，证明C1-R可作为一个很好的衡量打枪效果的指示，同时还证明其在双子叶植物——烟草叶片的基因枪转化瞬时表达体系中也起同样的作用。

中图分类号：Q75文献标识码：A

文章编号：0379-4172（2000）01-0065-0069

Estimation of Biolistic Transformation Effect by Transient Expression of C1-R Regulatory Genes of Anthocyanin Biosynthesis

SHAN Li-Bo,LI Yi-Wen,ZHAO Tie-Han,LIANG Hui,OUYANG Jun-Wen,JIA Shuang-E,JIA Xu

(Institute of Genetics,Chinese Academy of Sciences,Beijing 100101,China)

Abstract:In the present study,the transient expression of maize C1-R regulatory genes of anthocyanin biosynthesis in maize calli,wheat immature embroys,rice calli and tobacco leaves were described.C1-R regulatory genes could activate anthocyanin biosynthesis in vivo and the pigmented cells were visible.For major crops,including maize,wheat and rice,which were transformed mainly by biolistic method,C1-R genes were novel visible markers,and the expression was easier to detect than GUS gene.And these genes also worked well in transient expression in biolistic transformation system of tobacco leaves.

Key words:anthocyanin;transientexpression;biolistictransformation;plant transformation;GUS

目前，转化技术已成为植物遗传操作中的一项常规手段。对于一些主要的单子叶作物如小麦、玉米、水稻，基因枪法仍是主要转化方法。在某些转化机理的研究中，即使是对于农杆菌易于转化的双子叶植物如烟草、拟南芥，基因枪法仍占有举足轻重的地位^［1］。但由于基因枪的高成本以及枪击后线性增加的工作量，研究人员必然迫切要求提高枪击质量。目前，基因枪法中衡量打枪效果的常规方法，一是在解剖镜下镜检金粉的分布情况，但金粉分布均匀与否与转化效果并无必然联系，因而只是粗略评估打枪效果的一个方面。二是通过GUS染色，由于被检材料需染色处理，这不仅程序繁琐，而且材料经处理而致死^［2］。因此，用这两种方法来评价基因枪转化效果常常具有一定的局限性。

花色素苷合成调节基因C1-R是花色素苷合成代谢途径中的一个调节基因，其编码的蛋白为花色素苷合成酶转录过程中的一个激活因子，能在活组织内开启花色素苷的合成^［3］。各种植物都有在体内不停地进行着复杂的花色素苷合成的功能。如果使调节基因C1-R在CaMV35启动子控制下，不仅能使其组成型表达，且不受单、双子叶植物物种的影响^［4］。Ludwig等曾报道将CaMV35S启动子－玉米花色素苷调节基因编码序列-Nos终止子嵌合基因，通过基因枪法转化玉米不同器官组织，并观察其瞬时表达效果，结果在胚芽鞘、中胚轴、胚根鞘、根、盾片节及叶毛中均观测到了红色细胞^［5］。Taylor等人在珍珠粟的研究上也曾有过类似报道^［6］。Lloyd等用农杆菌转化法将调节基因C1－R转化烟草和拟南芥，转化植株的花柱、花萼和根部均有红色细胞出现^［7］。上述研究尽管成功地转化了C1－R基因，但未见有报道将其作为衡量打枪效果的指标，尤其用于小麦、水稻的转化。由于C1－R基因表达后不需任何生色底物就可活体显现红色，有可能作为某种反应的指示。本研究观察了C1－R基因在小麦、玉米、水稻和烟草中的瞬时表达情况，并与GUS的表达作了比较，试图将C1－R基因瞬时表达效果作为衡量基因枪转化效果的早期指标。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1春小麦（Triticum aestivum L.）Bobwhite（本室保存）。

1.1.2玉米（Zea mays L.）P9-10／Z31（中国农大戴景瑞实验室提供）。

1.1.3水稻（Oryza sativa L.）中花9号（中科院遗传所田文忠实验室提供）。

1.1.4烟草（Nicotiana tabacum L.）Nc89（中科院遗传所朱祯实验室提供）。

1.1.5质粒pC1，pBperu含CaMV35S启动子-GUS基因编码序列-Nos终止子嵌合基因（Stanford大学Lloyd实验室提供）。

1.1.6质粒pBI101含CaMV35S启动子-GUS基因编码序列-Nos终止子嵌合基因（中科院遗传所李家洋实验室提供）。

1.2方法

1.2.1小麦幼胚小麦授粉后12～14d，取下未成熟种子，经70%乙醇灭菌3min，剥出幼胚，盾片朝上，接种于补加2mg／L 2，4-D的MS基本培养基上，26℃预培养3d。

1.2.2玉米愈伤组织取授粉约12d的幼胚，灭菌后接种于补加2mg／L 2，4-D的N₆培养基诱导愈伤，经2～3次继代后用于打枪。

1.2.3水稻愈伤组织成熟种子灭菌后，取出种胚并接种于补加2mg／L 2，4-D的N₆培养基上诱导愈伤，愈伤经2～3次继代后用于打枪。

1.2.4烟草叶片取幼嫩烟草叶片，表面灭菌后置MS培养基上打枪。

1.2.5基因枪轰击基因枪采用Bio-Rad PDS 1 000／He型，轰击压力1 100Psi，按每枪500g金粉与1μg DNA配制子弹，金粉直径1μm，具体操作按Klein等人的方法^［1］。

1.2.6GUS组织化学染色将被试材料置X-Glu反应液中37℃温育6h，70%乙醇室温5h脱色，具体操作按Taylor等人的方法^［8］。

2结果与分析

2.1C1-R基因在小麦、玉米、水稻、烟草叶片中的表达

枪击24h后，解剖镜下放大2倍即可观察到花色素苷的表达，但由于在高渗培养基中，红色细胞数目较少，至48～72h后，即可清晰观察，如图版所示。对于小麦和玉米，愈伤组织表面的红色细胞清晰可辨，各自独立分布且颜色呈红色，极易计数（图版-1，2）。而水稻愈伤组织表面出现趋向浅橙色的细胞，26℃培养温度下不易辨清独立表达的红色细胞（图版-3），但于4℃过夜后有利于色素积累，可清晰观察到绛红色斑点。烟草叶片在枪击24h后，看不出任何表达的迹象，待72h后逐渐清晰，斑点偏紫黑色（图版-4），连叶毛的末端也呈现鲜红色，清晰可见（图版-5）。

2.2恢复培养时间与C1-R基因相对表达量之间的关系

枪击后1，2，3……天分别统计小麦幼胚、玉米愈伤组织、水稻愈伤组织和烟草叶片表面出现的红色斑点数，以斑点数的多少以及斑点颜色的深浅来评估C1-R基因的表达水平。统计结果表明，在不同材料中C1-R基因的表达时间和表达强度均不相同（图1）。玉米的最早，在恢复培养的第1d就能观察到红斑，第2d斑点数达到高峰，斑点颜色最深。 小麦在恢复培养后第2d也达到高峰，斑点颜色较深，也极易观察。而水稻枪击24h后表达并不强，72h后才急剧上升，虽然斑点的界限不象小麦和玉米的那样清楚，但仍可清楚的辨别。烟草叶片枪击24h后看不出任何表达迹象，至72～90h后达到高峰。这些结果表明，尽管C1-R基因在这些材料中表达的时间和水平各有差异，但表达高峰滞留期均为5d。由此可以认为，一般在恢复培养48h后即可观察C1-R基因的表达，从而估计打枪效果。

图1恢复培养时间与Cl-R基因相对表达量之间的关系

Fig.1The relationship between post-bombardment cultrue time

of wheat immature embryos and the expression of genes Cl-R

2.3小麦幼胚胚龄及预培养时间对C1-R基因表达的影响

在实验中还观察到同为小麦幼胚，预培养4d枪击48h后统计每块幼胚的红斑数。对于胚龄8d，幼胚直径0.5～1.2mm者，C1朢基因表达强度远远高于胚龄14d、幼胚直径1.5～2.0mm者。偏小者平均每块幼胚红色斑点数多至40～60个，而偏大者仅为5～7个。而预培养时间亦严重影响C1朢基因的表达。不经预培养的幼胚，平均每块幼胚的红色斑点不超过10个，而经预培养1～2d再枪击者红色斑点数明显增多。原因可能是偏幼嫩胚和经预培养胚的表面细胞组织较松软，子弹易于射入，被转化细胞相对较多，且细胞增殖较快，所以瞬时表达效果较明显。但由于幼嫩者后期分化能力减弱，亦或由于子弹（金粉）过多地射入细胞，对细胞损伤过大，使其在后期分化得苗率中效果反而不好。但经预培养对提高转化频率的效果是肯定的^［1］。因此，基因枪转化法中选择适宜发育期的受体非常重要。这些现象启示我们，可以根据打枪后C1-R基因的表