摘要：利用烟草碱性β-1，3-葡聚糖酶及菜豆碱性几丁质酶基因构建了组成型表达的双价植物表达载体pBLGC,利用农杆菌介导法转化了烟草，并得到了转基因植株。对其进行分子生物学分析的结果表明，部分转基因植株在所有检测中都显示较强的阳性反应，这说明外源基因已整合到烟草基因组中并得到正确表达。活体接菌实验初步表明，转基因植株与对照相比，对赤星病的侵染具有较强的抵抗能力。

中图分类号：Q812文献标识码：A

文章编号：0379-4172(2000)01-0070-0077

Studies of Transgenic Tobacco Plants Expressing β-1,3-Glucanase and Chitinase Genes and Their Potential for Fungal Resistance

LAN Hai-Yan,LIU Gui-Zhen,ZHANG Li-Hua,WANG Lan-Lan,CHEN Zheng-Hua

(Institute of Genetics Chinese Academy of Sciences,Beijing 100101,China)

TIAN Ying-Chuan

(Institute of Microbiology Chinese Academy of Sciences,Beijing 100080,China)

WANG Chang-Hai

(Institute of Industrial Crops Xinjiang Academy of Agricultural Sciences,Urumqi 830000,China)

Abstract:Plant bivalent expression vector pBLGC for basic tobacco β-1,3-glucanase and bean chitinase genes were constructed,and the tobacco tissue was transformed.Transgenic tobacco plants were carried out for analysis by PCR,PCR-Southern blot,Dot blot,Western blot,etc.,and the results showed that some transgenic plants gave strong positive signal,it suggested that foreign genes have been integreted into tobacco genome,and expressed correctly.Fungal challenge with Alternaria alternata showed that transgenic plants were much more resistant to this pathogenic fungus.

Key words:β-1;3-glucanase gene;chitinase gene;fungal resistance;transgenic tobacco plant

当植物受到病原菌及其他胁迫条件诱导时，会产生大量的病程相关蛋白（PRs），它们与植物的防卫反应关系密切。迄今为止纯化到的PRs中，大多数具有几丁质酶和β-1，3-葡聚糖酶活性^［1］。目前这两类蛋白也是报道最多的与抗真菌有关的蛋白。它们在体外能水解真菌细胞壁的两种主要成分——几丁质和葡聚糖，因而受到普遍关注。这两种酶均具有3种以上的类型，第类为碱性酶，分布在液泡中，在体外具较强抑菌活性；第、类为酸性酶，分布在细胞间隙，体外几乎无抑菌活性^［2］，但可能与诱导早期防卫反应有关。总之，植物中不同类型的几丁质酶及β-1，3-葡聚糖酶在防卫反应中起着不同的作用．通常由于第Ⅰ类几丁质酶和β-1，3-葡聚糖酶可直接破坏真菌顶端生长平衡而被广泛用于植物抗真菌病基因工程中．体外抑菌实验已经证明，这两种酶同时作用于真菌时，具有很强的协同作用^［3～5］，这一事实为抗真菌基因工程提供了依据。Zhu等（1994）利用组成型表达苜蓿β-1，3-葡聚糖酶 与水稻几丁质酶基因的转基因烟草做亲本，杂交筛选同时含有两种基因类型的植株，活体接菌实验结果表明，两者具有较高的协同效应，能有效抵抗尾孢菌（Cercospora nicotianae）的侵染^［6］。

基于上述研究结果，我们利用菜豆几丁质酶和烟草β-1，3-葡聚糖酶基因构建了双价植物表达载体．用此双价体转化了烟草，旨在探讨其抗真菌效应及转基因的遗传规律．目前已得到烟草转基因植株，并进行了活体接菌实验，现正对其子代的遗传及分离情况进行统计，期望在此工作基础上，为其他作物的抗真菌病转基因研究提供依据．

1材料和方法

1.1材料

1.1.1植物材料植物转化所用烟草品种为K326。

1.1.2菌种与质粒 DH5α为大肠杆菌受体菌，根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）LBA4404为农杆菌受体菌，pD12为植物表达载体，pBLG为本实验室构建的植物表达载体（含β-1，3-葡聚糖酶cDNA），pBch（含有几丁质酶cDNA）为本实验室构建的植物表达载体。

1.1.3酶与试剂各种限制性内切酶购自Boehringer Mannhein、BRL、Bio朙ab及Promega等公司。Taq DNA聚合酶购自上海生物工程有限公司；T4DNA连接酶购自Bio朙ab公司；DNA Labelling Kit (Ready-To-Go）购自Pharmacia公司，碱性磷酸酯酶标记的羊抗兔抗体NBT及BCIP购自Promega公司；β-1，3-葡聚糖酶兔抗血清由中科院遗传所实验动物中心协助制备．

1.1.4测试真菌链格孢菌（Alternaria alternata）菌种购自中科院微生物所菌种保藏室。将其转接到PDA培养基（马铃薯提取液1.0L，葡萄糖20.0g，琼脂15.0g）上使菌丝在25℃～28℃光照下生长4周左右，然后用于接菌实验。

1.1.5PCR引物检测β-1ρ，3-葡聚糖酶 基因引物：5′GC GGATCC GACCATGG CTGCTATCACACTCC 3′；3′ 端引物： 5′CG GTCGAC CTCACATCTC ACTTACGAGA 3′。检测几丁质酶基因引物：5′端（CaMV355启动子）引物：5′CTGACGTAAGGGATGACGC 3′；3′ 端引物：5′GGGATGACAGTGTCACTGAG 3′。

1.2方法

1.2.1植物双价表达载体的构建植物表达载体pBch含有“35S启动子—菜豆几丁质酶cDNA—Nos终止子”的表达框架，利用基因两端相同的EcoRⅠ酶切位点，将基因切下，补平并回收片段；同时将植物表达载体pD12（含有35S启动子，增强子和Nos终止子）用BamHⅠ和SalⅠ双酶切后补平，再与几丁质酶cDNA连接，得到表达载体pDch后，用HindⅢ将“35S启动子—Ω增强子—chi-cDNA—Nos终止子”表达框切下并回收此片段，与同样酶切并含有“35S启动子—Ω—glu-cDNA—Nos终止子”表达框的植物表达载体pBLG^［7］连接，筛选转化子，酶切鉴定。

1.2.2植物双价表达载体的农杆菌转化及鉴定农杆菌感受态细胞制备、转化方法及鉴定参照文献［8］进行。

1.2.3烟草叶片组织的遗传转化及抗Kan再生苗筛选按文献［9］所述方法进行。

1.2.4转基因烟草的PCR及PCR-Southern杂交分析（1）植物总DNA的提取：采用CTAB法，参照文献［10］方法进行。（2）转基因烟草的PCR分析：取以上制备的总DNA1μ1（～100ng），用检测β-1，3-葡聚糖酶基因的引物，或几丁质酶基因的引物，按标准反应程序进行PCR扩增。具体条件为：94℃预变性3min；94℃变性1min，55℃复性1min，72℃延伸1min，循环30次；72℃延伸10min。反应总体积为20μl，反应结束后，取10μlPCR产物，进行琼脂糖凝胶电泳。（3）PCR-Southern杂交：取PCR阳性反应的产物在0.8%琼脂糖胶、80V电压下电泳1～2h后，按文献［11］方法进行转膜与杂交。用HindⅢ酶切（含几丁质酶基因）或EcoRⅠ酶切（含β-1，3-葡聚糖酶基因）植物双价表达载体pBLGC，分离并纯化含几丁质酶基因或β-1，3－葡聚糖酶基因的片段，用于探针标记．按Pharmacia公司DNA Labelling Kit (Ready-To-Go）提供的随机引物法标记探针。

1.2.5转基因烟草的点杂交分析将100～500ng总DNA点在尼龙膜上，使携带DNA的一面暴露于紫外光源（254nm）下2min，然后将此膜直接用于预杂交和杂交，具体操作同以上PCR-Southern杂交的程序。

1.2.6转基因烟草的Western blot分析参照文献［10］所述方法进行。其中一抗为免抗β-1，3-葡聚糖酶抗血清，此抗血清经过与非转基因烟草幼嫩叶征的丙酮处理干粉混合过夜，以消除抗血清中非特异成分以及烟草本身存在β-1，，3－葡聚糖酶基因的微量表达对转基因植株Western blot结果的影响。一抗按1：1000稀释。二抗为碱性磷酸酯酶标记的羊抗免抗体，按1：3000稀释。

1.2.7转基因烟草的抗真菌实验选取生长状况一致的转基因植株（5株）和非转基因植物（3株），将带有菌丝体的培养基切成0.5×0.5cm²小块，用保鲜膜将有菌丝的一面粘贴在植株第2或第3层幼叶背面，并使之固定^［6］，然后用透明大塑料袋将整株植物罩住，使之保持良好透光状态。真菌在28℃～30℃相对湿度达饱和状态下侵染植株10天后，观察感病情况。

2结果与讨论

2.1植物双价表达载体的构建及农杆菌转化

植物表达载体pBch以植物表达载体pBin437为基础而构建^［12］，它含有CaMV35S启动子，但不含有TMV“Ω”翻译增强子片段。为了增强其翻译水平，并减少几丁质酶基因两端的酶切位点（含有2个EcoRⅠ及BamHⅠ等位点，对进一步的载体构建不利），将几丁质酶基因从最内端的两个EcoRⅠ位点切下，补平，插入用BamHⅠ和SalⅠ双酶切后补平的载体pD12（含双表达框架的植物表达载体）即得到中间载体pDch，经酶切检查，几丁质酶基因以正确的方向插入载体中。用HindⅢ将pDch中含几丁质酶基因的表达框切下，插入到同样用HindⅢ酶切的植物表达载体pBLG（含有β-1，3-葡聚糖酶cDNA的植物表达载体）中，从而得到同时含有几丁质酶cDNA及β-1，3-葡聚糖酶cDNA两个表达框架的双价植物表达载体pBLGC（图1）。