中华流行病学杂志2000年第21卷第6期

邵根泽苏艳蓉黄革温博贵

摘要目的探讨CYP1A1、GSTM1基因多态性与食管癌遗传易感性的可能关系。方法采用PCR法对正常人和食管癌患者基因组DNA进行CYP1A1、GSTM1基因分型。结果食管癌组GSTM1(-/-)型频率(64%)高于正常对照组(50%)(P＜0.05); 食管癌CYP1A1基因I/I、I/V、V/V基因型频率与正常组相比差异无显著性，尽管食管癌CYP1A1基因I/V、V/V型频率(60%)稍高于正常对照组(50%)(P=0.16)。当研究对象按CYP1A1（I/I）和GSTM1基因分类时，发现：①在GSTM1（+）人群中，食管癌组CYP1A1(I/V、V/V)基因型频率(64%)高于正常组(41%)(P＜0.05)。②在CYP1A1（I/I）型人群中，食管癌组GSTM1(-/-)型频率(67%)显著高于正常对照组(40%)(P＜0.01)。结论GSTM1、 CYP1A1基因多态性与食管癌易感性相关，GSTM1(-/-)型个体食管癌易感性增高; gSTM1（+）/CYP1A1(I/V、V/V)型和GSTM1(-/-)/CYP1A1（I/I）型个体比GSTM1（+）/CYP1A1（I/I）基因型个体具有更高的食管癌的易感性。

关键词：食管肿瘤；细胞色素P450酶；谷胱甘肽硫转移酶；多态现象

细胞色素P450酶（CYP450）和谷胱甘肽硫转移酶（GST）分别是细胞内重要的Ⅰ相和Ⅱ相代谢酶，在致癌物的活化和解毒过程中起重要作用。人类GST基因家族分为α、μ、π、θ四型^［1］，GSTM1基因是其中的一个亚型，定位于染色体1p13，有GSTM1a、GSTM1b、GSTM1(-)三个等位基因，其中GSTM1(-)是空白等位基因。GSTM1负责对苯并芘代谢的活性产物－环氧或羟化物的解毒，GSTM1(-/-)基因型个体缺乏GST酶活性，失去了解毒功能，增加个体患癌的危险性^［2］。CYP1A1定位于染色体15q²²-q¹⁴,编码芳烃羟化酶(AHH)^［3］。该基因第7外显子的点突变导致第462号密码子Ile→Val的改变，引起三种多态性：CYP1A1(I/I)、CYP1A1(I/V)、CYP1A1(V/V)。研究表明，其多态性与多种肿瘤易感性相关。在肺癌，CYP1A1(V/V)基因型个体肿瘤易感性增高^［4］。

食管癌是严重危害人类健康的疾病，流行病学调查表明，它不但与环境因素，而且与遗传背景相关。潮汕地区是南方沿海食管癌高发区，对该地区人群进行CYP1A1、GSTM1基因的分子流行病学调查研究，将有利于揭示食管癌发生的病因，提高对肿瘤易感者预测的水平。

材料与方法

一、标本

经临床病理检查确诊为食管鳞状细胞癌患者107例，其中男74例，女33例，年龄30～70岁,平均年龄(55±5.4)岁。标本取自汕头大学医学院附属肿瘤医院，为新鲜手术癌组织标本。正常对照血液标本111例取自汕头市职业病防治所，其中男80例，女31例，平均年龄(53±4.8)岁，为正常体检标本。所有标本均取自潮汕籍人群，部分患者有吸烟史。病例组和对照组在年龄、性别、民族构成上均衡可比。

二、DNA提取

取患者癌组织匀浆或提取正常人外周血白细胞，加入适量DNA抽提液和蛋白酶K（80μg/ml），55°C消化3 h。酚、酚/氯仿、氯仿各抽提一次，乙醇沉淀、70%乙醇洗涤晾干后，溶于适量10 mmol/L Tris-Cl,1 mmol/L EDTA(pH 8.0)溶液中。

三、基因分型

1.GSTM1基因分型^［5］：合成以下引物P₁：5′-CGCCATCTTGTGCTACATTGCCCG-3′， p₂：5′-ATCTTCTCCTCTTCTGTCTC-3′， P₃:5′-TTCTG

gATTGTAGCAGATCA-3′。PCR扩增：反应总体积50 μl，其中200 μmol/L dNTPs; 10×PCR Buffer 5 μl; 1.5mmol/L MgCl₂; 基因组DNA 0.2 μg;引物P₁ 600ng , P₂ 300ng, P₃ 300ng;矿物油30 μl。96℃ 预变性6 min；加入Taq DNA 聚合酶1.5 U后，置于GTC-2热循环仪上反应：94℃40 s，52℃ 60 s，72℃ 50 s，35个循环；72℃ 6 min。琼脂糖凝胶电泳检测。

2. CYP1A1基因分型^［6］：引物P₄：5′-GAACT

gCCACTTCAGCTGTCT-3′, P_5a: 5′-AAGACCTC

cCAGCGGGCAAT-3′, P_5b: 5′-AAGACCTCCCAG

cGGGCAAC-3′。 96℃预变性6 min；加入Taq DNA 聚合酶1.5 U后，置于GTC-2热循环仪上反应：95℃50 s，70℃ 60 s， 30个循环。琼脂糖凝胶电泳检测。

四、统计学分析

以χ²检验分析GSTM1、CYP1A1基因多态性与食管癌遗传易感性的关系，以比值比（OR）及其95%可信区间（CI）表示相对危险度。用Hardy-Weinberg遗传平衡定律拟合、χ²检验分析对照组CYP1A1各基因型频率，评估其代表性。

结果

一、基因分型

P₁、P₃是GSTM1基因型特异性引物，扩增GSTM1基因外显子4与外显子5间一230 bp DNA片段；P₁、P₂扩增产物为一157 bp DNA片段，作为实验内对照。凡GSTM1基因阳性［GSTM1(+/+)和GSTM1(+/-)］标本均可同时扩增出157 bp、230 bp两DNA片段；而GSTM1（-/-）基因型标本只扩增157 bp DNA片段，无230 bp特异DNA片段（图1）。CYP1A1有Ile纯合子（I/I）、杂合子（I/V）以及Val纯合子（V/V）三种基因型：只扩增引物P₄、P_5a的标本，其基因型为I/I；只扩增引物P₄、P_5b的标本，其基因型为V/V；二对引物均扩增者为I/V型（图2）。

图1GSTM1基因PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳(2%)图谱

二、正常对照人群各基因频率及基因型频率

CYP1A1 Ile基因频率为0.725，Val基因频率为0.275。CYP1A1 I/I、 i/V 、V/V基因型频率分别为0.50、0.46、0.04，预期基因型频率为0.526、0.399、0.076，经χ²检验差异无显著性（χ²=2.584, p＞0.1），符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律，因此该人群具有代表性。GSTM1（-/-）基因型频率为0.495，GSTM1（+）基因型［GSTM1(+/+)和GSTM1(+/-)］频率为0.505。

图2CYP1A1基因分型

三、食管癌患者GSTM1 、CYP1A1基因型频率

食管癌和正常人GSTM1 、CYP1A1基因分型结果见表1。在107例食管癌患者中，39例（36%）GSTM1基因阳性，68例（64%）为GSTM1(-/-)基因型；而对照组111例正常人标本中检测到56例（50%）GSTM1基因阳性，55例（50%）为GSTM1(-/-)基因型。经统计学分析，两组GSTM1(-/-)基因型频率差异存在显著性(P=0.0384＜0.05，OR=1.76，95%CI：1.027～2.737)。食管癌CYP1A1 I/I、I/V和V/V基因型频率分别为40%、52%和8%；与正常对照组相比（50%、46%、4%）差异无显著性（P＞0.05）。但食管癌CYP1A1含至少一个Val等位基因(I/V+V/V)的频率(60%)比正常对照高(50%)（P=0.16）。

四、CYP1A1(I/I)基因型人群GSTM1(-/-)基因型频率比较

43例CYP1A1(I/I) 基因型食管癌患者中，29例（67%）为GSTM1(-/-)基因型；而55例CYP1A1(I/I)基因型正常人中只有22例（40%）为GSTM1(-/-)基因型，两组GSTM1(-/-)基因型频率差异存在显著性（表2）。

五、GSTM1（+）基因型人群CYP1A1(I/V+V/V)型频率比较

39例GSTM1（+）型食管癌患者中，64%为CYP1A1(I/V+V/V)型；56例正常对照中41%为CYP1A1(I/V+V/V)型，两组CYP1A1(I/V+V/V)型频率差异存在显著性（表3）。

讨论

研究表明，约90%的肿瘤发生可能与环境致癌因素有关，人群对各种致癌因子的反应存在明显的差异。这种个体肿瘤易感性差异主要是由于肿瘤易感基因（包括代谢酶基因）的遗传多态性所决定^［7］。

本文研究了GSTM1 、CYP1A1基因多态性与食管癌易感性的关系。结果表明，GSTM1(-/-)基因型在食管癌组频率显著升高（P＜0.05，OR=1.76）；当研究对象的基因型为CYP1A1（I/I）时，这种差异更加显著（P＜0.01,OR=3.11）。以上提示GSTM1(-/-)基因型个体食管癌易患性增高。GSTM1基因产物可能参与致癌物的解毒，GSTM1(-/-)基因型个体缺乏GSTM1酶活性，不能代谢这些致癌物，从而导致肿瘤易感性增高。目前研究已经证实，GSTM1基因多态性与肺癌、结肠癌、膀胱癌、皮肤癌等肿瘤的易感性相关，GSTM1(-/-)基因型个体患癌的危险性明显增加，尤其是那些重度吸烟患者^［5,7,8］。

本文对CYP1A1的研究表明，食管癌组CYP1A1各基因型（I/I、I/V、V/V)频率分布与对照组相比差异无显著性，尽管CYP1A1“异常”基因型（I/V、V/V）频率在食管癌组有升高的趋势（50%→60%，P=0.16），这与Nimura^［9］对日本食管癌的研究结果较为一致。但当研究对象按GSTM1基因分类时，发现在所